聚合酶链式反应原理及步骤

 

1、聚合酶链式反应

 

简称PCRPolymerase Chain Reaction)(又称:多聚酶链式反应)。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

 

2、原理

 

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA 扩增技术,是以单链DNA为模板,4种dNTP为底物,在模板3末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增,从而在短时间内使DNA片段在数量上呈指数增加。

 

聚合酶链式反应

图1 PCR原理示意图(来源:百度)

 

3、步骤

 

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

 

(1)模板DNA的变性

 

模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。

 

(2)模板DNA与引 物的退火复性

 

模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

 

(3)引物的延伸

 

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

 

PCR扩增

图2 PCR扩增流程图(来源:百度)

 

注:参与PCR反应的物质主要为五种:引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

 

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