PCR疑难问题粉碎机（二）——荧光定量PCR

 

 

【前情回顾】PCR疑难问题粉碎机（一）——终点PCR

 

实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。目前它主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

 

荧光定量PCR，qPCR

 

荧光染料法

 

在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。

 

武汉艾美捷科技专注为客户提供整体打包方案，可提供EvaGreen、SolisGreen和SYBR等多种染料qPCR预混液。

 

荧光染料法

 

EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen属于饱和荧光染料。非饱和荧光染料在浓度高的时候会对PCR过程产生抑制，所以在荧光定量实验时使用浓度稍低，染料不能占据DNA双链上的所有位置。当PCR随着温度上升，双链逐渐解链，染料会从已解开的单链上脱落，然后结合到临近的尚未解链的双链中去继续发荧光。这种染料重排导致在较小的温度变化内，虽然DNA双链的解链过程不同，但荧光值是几乎不变的，也就是说，其溶解曲线不能精确反应双链的解链情况。

 

所以，对于非饱和染料，其溶解曲线分辨率相对较低，只能区分特异性的产物，不能分辨单碱基的差异。饱和荧光染料在DNA双链中所有可结合位点内都会有染料分子存在，染料与DNA的结合呈饱和状态，随着温度上升，在双链解链、染料脱离过程中，未解链的双链部分不存在染料可以结合的位点，染料不能发生重排。所以使用饱和染料制作的溶解曲线分辨率很高，可以精确反映DNA双链随着温度的解链情况，精度可以达到单碱差异的区分。

 

荧光标记的探针法

 

PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团， 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。

 

荧光标记的探针法

 

染料法VS探针法

1.探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，探针法能够用多重体系反应，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高

2.染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好

 

荧光定量PCR

 

类型 货号 名称
染料法 EvaGreen染料 08-36-00001 5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix 5×qPCR 预混液
08-24-00001 5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX) 5×qPCR预混液,ROX
08-25-00001 5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (no ROX) 5×qPCR预混液,无ROX
08-26-00001 5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) 5×qPCR预混液,Capillary
SolisGreen染料 28-41-00001 SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (no ROX)  5×qPCR预混液,ROX
28-46-00001 SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (ROX) 5×qPCR预混液,无ROX
SYBR染料 QP031 qPCR预混液2.0,ROX
QP041 qPCR预混液2.0,无ROX
探针法 08-17-00001 5×HOT FIREPol ® Probe Universal qPCR Mix
QP036 5×探针qPCR预混液,ROX
QP046 5×探针qPCR预混液,无ROX
08-16-00001 5×HOT FIREPol® Probe qPCR Mix Plus (Capillary)
 

多重qPCR

 08-01-00001 5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix 5x多重探针qPCR预混液
08-02-00001 5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Rox) 5x多重探针qPCR预混液,Rox
08-03-00001 5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Purple) 5x多重探针qPCR 预混液,Purple
 

 

 

快速qPCR

 28-21-00001 SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (no ROX) 快速探针qPCR预混液,含UNG,无ROX
28-22-00001 SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (ROX) 快速探针qPCR预混液,含UNG,ROX
28-23-00001 SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (Purple) 快速探针qPCR预混液,含UNG,Purple
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qPCR系统知识汇总

 

  1. 在qPCR 技术中重要的参数指标有哪些？

 

扩增及溶解曲线：扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映qPCR的动态进程；溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰，如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。

 

荧光域值（threshold）: 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。

 

Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。将已知浓度的标准品梯度稀释进行qPCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。

 

扩增及溶解曲线

 

  1. 扩增曲线一般分为哪几个阶段

 

荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期，

 

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入平台期，在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

 

荧光扩增曲线

 

  1. ROX染料是什么作用？

 

ROX（Passive Reference Dye）是一种惰性参比染料，在qPCR反应中能被qPCR仪检测到。ROX不参与qPCR反应，荧光信号值不会随着qPCR扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异：不均匀的照明，孔与孔之间光学因素（液滴、气泡）的因素，反应体系的浓度不同…… 可以用ROX作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，以提高数据的精确度。

 

  1. Ct值多少才算理想

 

一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是绝对的，需要辅以溶解曲线加以解释。

 

*** qPCR 常见问题分析 ***

 

问题类型 原因分析
无Ct值出现 * 检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号；
* 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
* 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
* 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况
Ct 值出现过晚（Ct>38） * 扩增效率低：反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；
* PCR各种反应成分的降解或加样量不足；
* PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度
标准曲线线性关系不佳 * 加样存在误差：使得标准品不呈梯度；
* 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品
* 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；
* 模板中存在抑制物，或模板浓度过高
扩增曲线异常，比如 S 型曲线 * 参比染料设定不正确：预混液不加参比染料时，选NONE；
* 模板的浓度太高或者降解；
* 荧光染料的降解
负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰 * 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现
* 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比
* 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒；
扩增效率低 * 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；
* 反应条件不够优化：可适当降低退火温度；
* 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响

 

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