荧光信号放大:TSA优秀替代品—PSA技术

 

Power Styramide™信号放大(PSA™)是一种新颖的酶检测信号放大方法,用于检测细胞和组织中的低丰度靶标。通过将iFluor™染料的卓越亮度和光稳定性与多HRP介导的PSA™成像相结合,可产生明亮的荧光信号,其准确性和灵敏度明显高于传统的免疫组织化学,免疫细胞化学和原位杂交技术。

 

Power Styramide™信号放大PSA

与酪酰胺信号放大(TSA)相似,PSA利用辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性原位共价沉积荧光团。 PSA自由基具有比酪胺自由基高得多的反应性,使得PSA系统比传统的TSA试剂更快,更稳健和灵敏。与酪胺试剂相比,Styramide 缀合物具有以更高效率标记靶标的能力,因此产生显着更高的荧光信号。PSA™成像技术可以轻松应用于任何检测过程中需要加入HRP的应用中,例如IHC,ICC,IF,  原位杂交和ELISA。

 

PSA™检测方法检测原理示意图

图1.PSA™检测方法检测原理示意图。使用常规的检测方法,用未标记的一抗和HRP-二抗缀和物检测细胞或组织样品。HRP催化标记的Styramide™转化为高活性的Styramide™自由基,这些自由基与酶位点上或附近的酪氨酸残基共价结合。

 

PSA™成像系统的优势

每个HRP标签的多个Styramide™底物的快速催化和共价沉积所产生的Power Styramide™信号放大转化成了许多实际优势,包括简单,灵敏度和特异性增强以及与其他技术的兼容性。Styramide™基团的较高反应活性,使其在HRP-靶标相互作用位点更牢固,更快速地标记,从而比TSA产生更强的信号和更好的空间分辨率。

 

PSA™特点及优势

  • 超灵敏的低丰度靶标检测,比IHC,ICC和IF方法高100倍
  • 高荧光强度,比酪酰胺(TSA)高10至50倍
  • 与其他荧光标记,染色技术和PSA™成像试剂盒兼容,可进行多重分析
  • 与放射线检测相比,PSA™自由基具有更高的反应活性,可提供更快的结果以及同等的灵敏度和分辨率
  • 保留珍贵的抗体,PSA™标记可减少一抗使用量,也能达到同等水平的灵敏度
  • PSA™成像试剂盒易于使用,并提供足够的试剂用于100次测试

 

iFluor™594 Styramide™ (货号45035 AlexaFluor®594 tyramide(货号11082

 

优越的检测灵敏度

将PSA™成像应用于免疫染色实验中,可以增加一抗稀释度,而不会使测定灵敏度降低。此外,增加一抗稀释度会降低非特异性背景信号,并克服固定方法不当或目标表达水平低引起的免疫标记不足。

 

Power Styramide™信号放大(PSA™)套件的灵敏度

图3. Power Styramide™信号放大(PSA™)套件的灵敏度。固定,渗透并用不同浓度的兔抗微管蛋白一抗标记HeLa细胞。厂商建议的稀释度为1:500或2ug / ml。然后,在我们的iFluor™488 PSA™成像试剂盒中用山羊抗兔IgG,AlexaFluor®488标记的酪酰胺或AlexaFluor®488标记的山羊抗兔IgG的试剂对细胞进行染色。在相同条件下(使用FITC滤光片组并在相同的曝光时间下进行分析)从每种处理中捕获细胞图像。测量了相对荧光信号强度,并比较了不同检测方法之间的荧光强度。

 

多种PSA™多重染色

PSA™系统经过设计,可与其他荧光发生器,细胞和组织染色技术以及其他PSA™成像套件兼容,从而可以同时可视化多个目标。与TSA和荧光二抗相比,PSA™的检测阈值较低,还可以检测在同一宿主物种中产生的,但信号之间无明显串扰的两个靶标。PSA™成像兼容:

  • 荧光标记和复染物(例如DAPI,Hoechsts)
  • 荧光蛋白(例如GFP,YFP,RFP)
  • 其他Styramide™试剂
  • 其他PSA™成像套件
  • 酪酰胺试剂和酪酰胺成像试剂盒
iFluor™488 PSA™试剂盒(货号:45205
iFluor™555 PSA™试剂盒(货号45270
DAPI (货号17507
合并后

图4.使用iFluor™PSA™成像试剂盒对甲醛固定,石蜡包埋的人肺腺癌依次进行免疫染色。用兔抗EpCam抗体和带有山羊抗兔IgG(目录号45205)的iFluor™488 PSA™成像试剂盒标记EpCam,然后洗涤。用小鼠抗Pan Keratin抗体标记Pan-Keratin,iFluor™555 PSA™成像试剂盒带有山羊抗小鼠IgG(目录号45270)标记。细胞核用DAPI(目录号17507)标记。在共聚焦显微镜上采集图像。

 

灵活的工作流程:与IHC,ICC,ISH和流式细胞仪兼容

PSA™成像技术可适用于能在其检测方案中添加HRP的任何应用,并且与免疫学应用中常用的样品类型和荧光成像平台兼容。与传统的IHC,ICC,ISH和FC应用程序结合使用时,PSA™成像可显著提高检测灵敏度,而不会降低图像分辨率或增加背景信号。

 

PSA™成像技术

 

1. 免疫细胞化学(ICC)

HL-60细胞的CD45表面受体染色。Hl-60细胞用4%甲醛固定,通透并用0.2 µg / mL抗CD45一抗标记。然后将细胞用iFluor™647 Styramide™染色,并使用Cy5滤光片拍摄的荧光图像。

 

免疫细胞化学

 

2. 原位杂交(ISH)

使用生物素化的PNA探针通过原位杂交着丝粒进行染色。使用标准方案将Jurkat细胞固定并透化,用链霉亲和素HRP缀合物检测每个染色体的着丝粒,并用iFluor 488苯乙烯酰胺试剂可视化,用DAPI染色细胞核。

 

原位杂交

 

3. 流式细胞仪

使用iF488标记的山羊抗兔IgG方法,酪酰胺方法或苯乙烯酰胺方法对Jurkat细胞中的pAKT进行流式细胞分析。苯乙烯酰胺扩增方法的信号强度比山羊抗兔IgG-iFluor™488直接染色高10倍,比Alexa Fluor 488酪酰胺染料染色高5倍。

 

流式细胞仪

 

PSA™成像工作流程:

PSA™成像利用辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性在原位生成目标蛋白或核酸序列的高密度标记。与IHC,ICC和ISH程序的常规工作流程相似,PSA™成像易于执行,包括几个简单的过程。在此工作流程中,将荧光二抗替换为多HRP标记二抗,唯一的附加步骤是与标记的Styramide™一起孵育。

 

1.固定,透化和封闭细胞或组织样品。用未标记的一抗,生物素化一抗或生物素化核酸探针孵育样品。

2.加入HRP标记二抗或HRP-链霉亲和素偶联物。

3.添加iFluor™染料Styramide™工作溶液,进行HRP催化的Styramide™沉积。

4.装入样品并检测信号。

 

PSA™成像工作流程

图5. Power Styramide™信号放大(PSA™)的工作流程。通过类似于常规ICC和IHC方法的工作流程,PSA™试剂盒和Styramide™试剂可以通过几个简单的步骤就可以对所需目标物进行灵敏检测。

 

Power Styramide™信号放大相关产品信息汇总:

Styramide™ 货号 Ex (nm) Em (nm) 滤光片 消光系数 量子产率
iFluor™ 350 Styramide™ 45000 345 442 DAPI 20,000 0.95
iFluor™ 488 Styramide™ 45020 491 514 FITC 75,000 0.9
iFluor™ 546 Styramide™ 45025 541 557 Cy3/TRITC 100,000 0.67
iFluor™ 555 Styramide™ 45027 552 567 Cy3/TRITC 100,000 0.64
iFluor™ 568 Styramide™ 45030 568 587 Cy3/TRITC 100,000 0.57
iFluor™ 594 Styramide™ 45035 587 603 Cy3/TRITC 180,000 0.53
iFluor™ 647 Styramide™ 45045 654 669 Cy5 250,000 0.25
iFluor™ 680 Styramide™ 45050 683 700 Cy5 220,000 0.23
iFluor™ 700 Styramide™ 45055 690 713 Cy7 220,000 0.23
iFluor™ 750 Styramide™ 45065 759 777 Cy7 275,000 0.12
iFluor™ 790 Styramide™ 45070 786 811 Cy7 250,000  0.13

 

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