倒置显微镜?相差显微镜?荧光显微镜?该如何选择

在细胞培养及相关衍生实验中,显微镜是一个很重要的仪器。目前,市场上有各种类型的显微镜,对于刚入行的小白来说,选择一款符合需求又适用的显微镜是一个挑战,下面小编为大家介绍几种显微镜的原理,便于大家选择。

 

1、倒置显微镜

 

倒置显微镜组成和普通显微镜一样,主要包括三部分:机械部分、照明部分、光学部分。其中与普通显微镜有明显区别的是:物镜与照明聚光系统的相对位置。相比于普通显微镜,倒置显微镜的物镜与照明聚光系统以载物台为轴颠倒位置,物镜在载物台之下,照明系统在载物台之上。这样的构造使得照明聚光系统与载物台的有效距离可以显著扩大,便于放置培养皿、细胞培养瓶等较厚的待观察器具(当然载玻片等也可以),而同时物镜与材料之间的工作距离不必很大。

 

由于倒置显微镜观察的材料一般都是培养的细胞,透明性大,结构对比不明显,故倒置显微镜常配备相差物镜,实际上也就构成了倒置相差显微镜

 

倒置显微镜

2、相差显微镜

 

镜检时,视场中的样品只有在其透射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有明显变化时,才能被眼睛所分辨。照明光线通过无色透明的物体时,透射光的波长和振幅都不发生明显改变,尤其是振幅,几乎无变化。所以用普通光学显微镜观察时,难以辨清这样物体的结构,必须借助于固定和染色等理化方法,使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化,即在颜色和亮度上有所差异,以供识别。

 

相差显微镜不同于普通光学显微镜,在装置上有四种必不可少的部件:相差物镜(内有相板)、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜、绿色的滤光镜。其关键是相差物镜和环状光阑,更具体地说是相板和环状光阑。光源产生的光透过环状光阑和聚光器成为环形光锥,照射在被检物上,产生了直射光和衍射光。二者分别通过相板上的共轭面和补偿面,并产生了干涉。共轭面和补偿面上的涂层分别能使直射光和衍射光产生1/4λ的相位滞后,因此导致干涉光的振幅加强和减弱,并由此产生了明反差和暗反差。使被检物即使不经染色,也可清晰分辨。详细光路图如下。

 

相差显微镜

 

3、荧光显微镜

 

荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。对被检物体来说,荧光产生方式有两种:自发荧光,经过紫外照射直接发出荧光;继发荧光,被观察物体经过荧光染料处理之后,经过紫外光照射才能发出荧光。细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后产生自发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发出继发荧光。

 

荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光(紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

荧光显微镜

荧光显微镜分为透射式和落射式两类,前者较为原始,后者较为先进。两类荧光显微镜的基本构建相似,主要区别为:透射式的激发光透过标本,标本整体产生荧光,荧光再进入物镜,放大倍数越高,荧光越弱;落射式的激发光投射在标本表面,标本表面产生荧光,荧光再进入物镜,放大倍数越高,荧光越强,适于进行高倍观察。荧光显微镜主要构件有汞灯光源、激发滤板、分色镜(落射式)、压制滤板、暗场聚光镜(透射式)等。此外,由于汞灯发热严重,大多还装有吸热滤镜。部分荧光显微镜还有相差物镜和环状光阑,因此可以进行相差观察。还有的荧光显微镜采取倒置构架,又是倒置显微镜,等等。

CCD组装成数码显微镜

 

此外,上述显微镜都可以通过安装CCD组装成数码显微镜,它是将显微镜看到的实物图像通过数模转换,使其成像在计算机上。从而,我们可以对微观领域的研究从传统的普通的双眼观察到通过显示器上再现,从而提高了工作效率。

 

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