在任何使用抗体进行信号检测的应用中(如Western blotting, ELISA,免疫组织化学,或FACS),抗体标记有两种方法:直接标记和间接标记。标准的WB使用间接标记,使用一抗检测目标抗原,然后使用一个带有检测分子的二抗。但在某些情况下,最好跳过二抗及其相关步骤,直接标记一抗,此种情况包括如下:
- 二抗有非特异性结合;
- 使用非标准生物的一抗,这时可能很难找到合适的二抗;
- 使用来自同一物种的多个抗体;
- 需要缩短实验时间时,可以省去二抗孵育和清洗等步骤。
标记抗体不仅可以用荧光染料,也可以用荧光蛋白、酶和有色粒子。通常是通过一个末端的赖氨酸基团来连接的,所以在实验步骤中需要避免使用含胺的缓冲液(如Tris)和分子,否则你标记的可能是你的缓冲分子。同时,避免使用常规的缓冲叠氮化钠防腐剂,因为它会干扰标记反应。
待标记的抗体浓度应不低于0.5 mg/ml, 纯度大于90%。在抗体准备过程中含有的干扰蛋白质和含氨基基团分子越少,标记反应的效率就越高。但即使抗体是在甘氨酸和BSA溶液中,也可以通过透析去除干扰物质。也可以通过Protein A蛋白柱来提高抗体的纯度,或者甚至可以为某个抗原准备亲和纯化柱。如下介绍抗体标记的五个常用方法。
一、NHS (Succinimidyl) Ester 琥珀酰亚胺
这种方法用于抗体和广泛使用的荧光染料如罗丹明衍生物。通常是在磷酸盐缓冲液中进行的,随后与未标记的染料在柱上分离。这种方法的主要缺点是,酯类是不稳定的,因为它们是对水分敏感的,反应结束后标记的抗体应该立即使用。
二、Isothiocyanate 异硫氰酸酯
可以使用这种方法制备异硫氰酸荧光素(FITC),它在荧光蛋白和抗体的制备中非常流行不同标准染料的异硫氰酸盐类似物也可用。
异硫氰酸酯比NHS更稳定,但它的制备更困难,而且使用这种方法,你的标记反应可能效率更低。与NHS一样,反应后过量的染料应该通过色谱法去除。
三、Carbodiimide 碳化二亚胺
碳二亚胺衍生的化合物将蛋白质的羧基转化成可以与赖氨酸反应的活性中间体。碳二酰亚胺的高反应性意味着它可以用相对惰性的材料标记抗体,如磁性或金颗粒。最常用的碳二酰亚胺是EDC。NHS有时会被加入到反应中,以帮助形成相对稳定的中间产物。该方法简单,但类似于NHS, EDS是易潮湿的,所以你需要在标记后立即使用你的抗体。
四、Two-Tag
用另一种蛋白质作为催化剂来标记抗体,例如HRP或碱性磷酸酶。由于这两种分子都含有大量的氨基基团,直接交联(与NHS的方法一样)会导致同一分子的聚合物,因此,应该在两个单独的步骤中进行连接。将抗体与分子X,催化剂与分子Y进行交联,需要仔细选择X和Y,它们相互作用形成共轭。例如,选择马来酰亚胺为X,硫醇为Y。
由此产生的共轭比NHS法获得的更稳定,但这种方法需要更多的工作量,分别对抗体、催化剂和共轭反应进行标记和纯化步骤。也可以购买预先标记的催化分子,然后相应地标记目标抗体。
五、高碘酸盐法
该方法用于生成特定的HRP -抗体轭合物。高碘酸盐通过产生与赖氨酸残基相互作用的醛分子来激活HRP。HRP本身只有少量的赖氨酸残基,所以酶的聚合并不是重要的问题。HRP与抗体之间的键是可逆的,除非加入氢化钠进行稳定。
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