临床免疫测定技术的发展历程【解读】

当机体感染病原微生物时，要想使临床医师尽早采取适当的措施进行治疗，人们就希望能尽快尽早地知道机体所感染的是何种病原体，传统的病原体感染诊断一般要经过这样一个过程，即首先对可能存在有病原体的体液或分泌物标本进行体外培养，培养后，再通过分析其形态学、生物学和生物化学特性，以确定其到底是哪一类及哪一种病原体。这是一种行之有效的方法，直至今天，其仍是病原体感染诊断难以替代的“金标准”，但是采用传统的培养方法诊断病原体感染，不但繁琐、费时以及效率低，而且并不是万能的，因为有一些病原体，或采用体外培养方法生长特别缓慢，或根本就没有合适的培养方法，这就使得这一类病原体感染的诊断难以进行。

随着人们对病原体感染与机体免疫应答的逐步认识，以抗原抗体特异反应为基础的，更为快速简便的免疫检验方法就应运而生了。总的来说，检测病原体感染的免疫检验方法根据其检测目的物可分为两类，一类是检测病原体抗原而直接反映病原体感染的方法，另一类是检测机体因对病原体的抗体应答所产生的抗体而间接反映病原体感染的方法。

临床免疫检验技术的出现最早可追溯至19世纪末。1896年，Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验(Widal test)。稍后，即1897年，Kraus又发现将细菌培养液与其相应的抗血清混合后可发生肉眼可见的沉淀反应，于是，免疫沉淀试验又应运而生。到1900年，维也纳大学病理解剖系的年仅32岁的助教Landsteiner发现在一些人的血浆能使另一些的红细胞凝集，这种同种凝集现象的发现，成为人类血型分类的基础，并由此而衍生了生物科学中的一个特殊分支即免疫血液学，Landsteiner也因人类血型的发现获得了1930年的诺贝尔生理学或医学奖。并且，直至今天，我们仍然在使用基本的红细胞凝集试验鉴定ABO血型。在同一年代，Bordet又发现了补体结合试验(complement fixation test，CFT)，即抗原抗体反应后具有补体结合的能力，如红细胞与溶血素反应后，如有补体存在即可出现溶血现象。因此，利用这种免疫溶血机制做指示系统，可以检测另一反应系统中抗原或抗体的存在与否。1906年Wassermann将这种试验用于梅毒螺旋体感染的诊断，建立了著名的华氏反应。

下面我们首先来看看免疫沉淀反应测定技术的发展历程。1902年Ascoli建立了环状沉淀试验。1905年Bechhold将抗体混溶在明胶中，然后再将相应特异抗原加于其上，抗原抗体的特异结合可在明胶中出现沉淀。1946年Oudin报道了试管单向免疫扩散试验。到1965年Mancini又提出了平板单向免疫扩散试验，这种试验的出现使得以前只能进行定性测定的免疫试验进入到了定量的时代，并且其仍是目前最为常用的简易抗原定量方法，如免疫球蛋白、补体C3和C4等的测定。由Ouchterlony首先报道的平板法双向免疫扩散试验，仍然是抗原抗体鉴定的最基本方法之一。由Grabar和Williams在内1953年首先报道的免疫电泳，其将区带电泳和免疫双扩散有机地结合了起来，可很方便地用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异体液蛋白的识别。其后，又出现了对流免疫电泳、火箭免疫电泳和免疫固定电泳(immunolixation electrophoresis，IFE)等。免疫沉淀反应发展到此，基本上可以说是经典免疫沉淀试验发展阶段，这些所谓的经典免疫沉淀试验不但测定范围狭窄(10～l00tg／m1)、灵敏度低，而且繁琐费时，不能自动化，因此，到了20世纪70年代，根据抗原抗体能在液相中快速结合的原理，出现了微量免疫沉淀试验，即免疫透射比浊测定、免疫胶乳比浊测定和免疫散射比浊测定，这几种比浊测定方法均已用于临床体液特定蛋白含量的测定，现已有多种自动化检测仪器应用于临床检验，尤其是免疫散射比浊测定。

免疫凝集反应测定技术则经历了直接凝集试验、间接凝集试验和自身红细胞凝集试验等几个发展阶段。直接凝集试验常用的有玻片法和试管法两种，如在玻片上进行的红细胞ABO血型的鉴定试验，在试管中进行的肥达试验和外斐试验(Weil-Felix test)以及交叉配血凝集试验等。间接凝集试验中曾经应用较为广泛的有间接血凝试验和胶乳凝集试验，如国内20世纪80年代初广为应用于HBsAg测定的反向间接血细胞凝集试验，用于hCG和类风湿因子(RF)测定的胶乳凝集试验等。自身红细胞凝集试验则是近些年来发展的不同于以前的免疫凝集试验的快速检验技术，其最大的特点是采用一种双功能抗体试剂，以患者自身红细胞作为凝集反应指示系统，检测方便快速，只要2min就完成凝集反应。

由上述可见，以免疫沉淀和免疫凝集反应为基础的免疫检验技术，除了免疫比浊外，均无需特殊的仪器设备，操作简单方便，有些具体测定方法，即使是在今天，仍有着广阔的应用空间，有其不可替代的一面，尽管如此，以免疫沉淀和免疫凝集反应为基础的免疫检验技术的局限性还是非常明显的，如测定灵敏度低，除少数外，基本上都是定性测定等，这些缺陷大大限制了其在病原体感染诊断及体液中微量生物活性物质测定中的应用价值。

如果我们将免疫沉淀和免疫凝集试验定为经典的免疫测定技术，那么，标记免疫测定技术就可以说是现代免疫测定技术，经典的免疫测定技术所不能解决的临床测定问题在标记免疫测定技术前均能迎刃而解。在标记免疫测定技术中最早使用的标记物是荧光素。

1941年Coons建立的荧光素标记抗体技术(fluorescent antibody technique)为定位组织和细胞中的抗原物质提供了一个直接而又有效的手段。在20世纪40年代以前，所出现免疫测定技术基本上都是定性或半定量测定方法，到50年代末60年代初，才出现完全的定量测定方法，即放射免疫试验(radio immnuoassay，RIA)。高灵敏放免测定技术的出现，解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题，其发明者之一Yalow因此而获得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖。尽管放免测定技术的出现是免疫测定技术发展史上的一个里程碑，但由于其有试剂半衰期短，实验废液难以处理，污染环境等缺点，使得其现已在逐步退出在临床常规检验中的应用，而采用非放射性核素标记物建立标记免疫测定技术成为发展主流。

1966年，美国的Nakane和Pierce以及法国的Avrameas和Uriel同时报道了酶免疫测定技术。其将酶替代荧光素，用于抗原在组织中的定位，可通过光学显微镜和电子显微镜来观察。60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等发展了一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，这种简单方便的免疫测定技术出现后，不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。

其后，1972年Rubenstein等又建立了一种无需分离洗涤步骤的均相(homogeneous)酶免疫测定技术——酶放大免疫分析技术(Enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT)，这种测定技术主要限于小分子物质如药物等的测定应用。

随着70年代中期杂交瘤技术的发展，出现了单克隆抗体，其应用于免疫测定，极大地提高了免疫测定的灵敏度和特异性，且为各种免疫测定方法的设计提供了广阔的想象空间，各种免疫测定技术相继出现，如一步法双抗体夹心酶免疫测定，酶联免疫电转移印斑法（EITB，或称Western Blot），各种均相酶标或放射性核素标免疫测定方法等。

80年代，研究人员又发现胶体金可以作为抗体的标记物，建立简便快速的免疫渗滤层析试验，即所谓的金标试纸条。

90年代，使用不同测定原理的各种自动化免疫分析仪不断应用于临床检验，如化学发光免疫测定（CLIA）、电化学发光免疫测定（ECLIA），给我们实验室的日常工作不但带来了很大的便利，而且其测定较之人工操作更为稳定和准确。

尽管上述这些标记免疫分析方法通过不断改进日趋成熟，但是，它们依然存在检测样品下限浓度不够低，灵敏度不高，很难定性定量地一次性检测同一个分析体系中产生的不同检测信号，而且微量化、自动化、高通量化程度都不高等缺点。克服传统免疫分析方法的不足，研发更加快捷、高效、灵敏、可靠、安全的多元免疫分析方法已经成为现代免疫技术发展的必然趋势。

多元免疫分析方法拥有较传统免疫分析更具独特性的优势：可一次性对多个待分析物进行检测，能有效降低采样偏差，通量更高，检测下限浓度低，灵敏度高，可进行痕量检测，有效提高筛选质量，从而减少昂贵分析样品的用量，极大地降低了分析成本。

多元免疫分析方法发展至今已有免疫聚合酶联反应技术、蛋白质微阵列芯片技术、流式细胞术、量子点技术以及多元均相时间分辨荧光免疫分析技术等。其中流式细胞术是发展比较完善的现代免疫分析技术，但其检测所需的设备和试剂盒昂贵，导致分析测试成本较高。

但是我们相信未来临床免疫测定技术发展会越来越好，各方面的缺点都会有很大的突破，会有更多的有效的方法被发现，从而在临床运用上可尽早采取适当的措施进行治疗。