蛋白实验的盛宴:揭秘蛋白互作全过程!

 

这次,小编又给大家带来了一波丰富多彩的生物科学奥秘——蛋白互作。如果把蛋白互作比作是一次兴趣盎然的“钓鱼”活动的话,那我们用的标签抗体偶联载体就是一个锐利而坚挺的“鱼钩”,标签重组蛋白(诱饵蛋白)就是香甜可口的“鱼饵”,而我们的靶蛋白就是那个在水里自由灵动的“鱼儿”了。

 

工欲善其事必先利其器,也许您此时还在为纯化富集靶蛋白没有一个好的抗体偶联Beads而发愁,也许您此时收集的蛋白含量少,也许您此时富集的蛋白杂质含量多,也许您此时历尽艰辛收获的蛋白活力却降低了,也许您现在用的Beads操作步骤冗长,花费时间多,也许,也许……

 

下面,小编给大家来一次蛋白实验的盛宴:揭秘蛋白互作的全过程,IP和Co-IP究竟是一个怎样的神奇操作?

 

一、免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

 

“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白,进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。更确切地说,IP是采用固定在微珠支持物(一般是琼脂糖树脂)上的特定抗体,从复杂的混合物中,纯化单-抗原的实验。固定化蛋白质复合物的组装既可以分步进行,也可以一步完成(图1)。常见的加样顺序:抗体和样本(如细胞裂解物)一起孵育,然后加入亲和微珠,用于捕获抗体-抗原复合物。也可以将抗体和微珠(通过抗体结合蛋白,如蛋白A、G或AG等,直接或间接结合抗体)先进行孵育,然后再加入含有抗原的样本。当抗原、抗体和固相支持物产生结合以后,充分洗涤微珠,再采用适当的洗脱缓冲液从支持物上洗脱抗原。

 

 

二、免疫共沉淀Co-IP

 

免疫共沉淀分析(Co-IP)与IP十分类似,基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体;但IP的目标是纯化单一抗原,而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体。在Co-IP实验中,已知抗原称为诱饵蛋白,与之结合的蛋白则称为靶蛋白。靶蛋白可能是一些复杂的伴侣蛋白、信号分子、结构蛋白、辅助因子等,蛋白间相互作用强度范围可能介于高度瞬时和十分稳定之间。基本的Co-IP实验方案与IP相同,实际上任何IP系统均可用于Co-IP。但是,还有许多其他因素需要考虑,例如,结合和洗涤条件的优化,优化时,需要考虑到诱饵蛋白-靶蛋白的相互作用强度以及抗体-诱饵蛋白的亲和力。

 

 

三、Co-IP流程

 

①样品准备

②蛋白抽提:加入适量含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,冰上裂解30 min后,于4°C,13000 rpm条件下,离心30 min,取上清,即为总蛋白样品。

③体系孵育

④体系洗涤

⑤WB检测

 

Co-IP的注意事项和优缺点

 

①温和的裂解条件

②使用明确的抗体

③使用对照抗体

 

Co-IP实验缺点:

可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体。所以,若预测不正确,实验就得不到结果。

 

Co-IP实验优点:

相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;蛋白的相互作用是在自然混合蛋白状态下进行的,可以避免人为的影响;可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

 

Co-IP和IP区别:

 

Co-IP:研究的是体内自然状态下的蛋白质互相作用,不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的。

 

IP:根据抗原和抗体的特异性结合,利用抗体将靶标蛋白分离或纯化,检测某一种蛋白的表达情况。

 

IP和Co-IP的技术升级

 

传统IP和Co-IP基本步骤:

 

 

  1. 添加合适的抗体。
  2. 抗体与目标蛋白结合。
  3. 添加Protein A/G使抗体-蛋白质复合物不溶。
  4. 溶液离心分离抗体-蛋白质复合物。
  5. 去除上清液并洗涤。

 

传统ProteinA/G在IP应用的局限性:

  1. 耗时
  2. 当抗体种属、亚型和ProteinA/G不匹配时,ProteinA/G和抗体结合能力弱
  3. 和样本中的其他免疫球蛋白结合,产生非特异性结合,导致高背景

升级之后的IP和Co-IP基本步骤:

 

 

  1. 添加合适的抗体偶联物。
  2. 抗体与目标蛋白结合。
  3. 溶液离心分离抗体-蛋白质复合物。
  4. 去除上清液并洗涤。

 

用了我们升级之后的琼脂糖/磁珠偶联标签抗体之后,我们可以很惊奇地发现,实验过程省去了一个耗时而且复杂的抗体与载体结合的实验操作,而且抗体与Beads的完美结合,提高了目标蛋白被“拉”下来的精准性,得到的靶蛋白纯度和产量都会明显提高,而且操作简便,省时省力!

 

说到这里,大家对咱们Abbkine的“蛋白利器”肯定已经迫不及待了,小编现在非常自豪地把我们的琼脂糖/磁珠偶联标签抗体隆重地推荐给大家:

货号 名称 运用
A02010AGB Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody, Agarose) IP和Co-IP
A02010MGB Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody, Magnetic Beads) IP和Co-IP
A02040AGB Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody, Agarose IP和Co-IP
A02040MGB Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody, Magnetic Beads IP和Co-IP
A02050AGB Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody, Agarose IP和Co-IP
A02050MGB Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody, Magnetic Beads IP和Co-IP
A02060AGB Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody, Agarose IP和Co-IP
A02060MGB Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody, Magnetic Beads IP和Co-IP
A02170AGB Anti-V5 Tag Mouse Monoclonal Antibody, Agarose IP和Co-IP
A02170MGB Anti-V5 Tag Mouse Monoclonal Antibody, Magnetic Beads IP和Co-IP

 

本期主要讲的是免疫沉淀的知识,时间有限,小编又得跟大家说再见了。下期同一时间,还有蛋白互作的Pull down操作小技巧与大家见面。敬请期待~~~~~

 

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