跑过WB的童鞋都知道,有时候显影出来的结果简直逆天到让你怀疑人生,怀疑自己。不过,世间万物均有迹可寻,在这里,小编根据自身经验以及其他小伙伴的经历,对各种奇葩结果进行一番总结归纳,快来瞅瞅吧,说不定就有你的呢。
问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
背景高 |
封闭不充分/未加封闭剂 |
延长封闭时间 |
更换合适的封闭剂(脱脂奶粉、血清、BSA等) |
一抗浓度过高 |
增加一抗稀释倍数 |
抗体孵育温度过高 |
4℃孵育 |
二抗非特异性结合 |
设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 |
一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 |
在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应 |
洗膜不充分 |
增加洗涤次数 |
膜不合适 |
NC膜比PVDF膜背景低 |
膜干燥 |
保证充分的反应液,避免出现干膜现象 |
没有阳性条带或很弱 |
一抗、二抗等不匹配 |
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参来验证二级检测系统的有效性 |
一抗或/和二抗浓度低 |
增加抗体浓度,延长孵育时间 |
封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 |
封闭时使用温和的去污剂,如Tween-20 |
更换封闭剂(脱脂奶粉、BSA、血清或明胶等) |
一抗不识别目的物种的靶蛋白 |
检查说明书,或做ClustalW比对,设阳性对照 |
样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低(抗原无效) |
设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白 |
转膜不充分,或洗膜过度 |
使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜 |
过度封闭 |
使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间 |
一抗失效 |
使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用 |
二抗受叠氮钠抑制 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂) |
酶和底物失效 |
直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物 |
曝光时间过短 |
延长曝光时间 |
多非特异性条带或条带位置不对 |
细胞传代次数过多,导致其蛋白表达模式分化 |
使用原始或传代少的细胞株,或多做平行实验 |
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式:乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等 |
查文献,使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小 |
蛋白样本降解 |
使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂 |
新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式 |
查其它文献报导,或BLAST搜寻,使用说明书报导的细胞株或组织 |
一抗浓度过高 |
降低抗体浓度,可以减少非特异性条带 |
二抗浓度过高 产生非特异性结合 |
降低抗体浓度,增加二抗对照 |
选择特异性更强,只针对重链的二抗 |
抗体未纯化 |
使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带 |
蛋白存在二聚体或多聚体 |
SDS-PAGE电泳上样前,煮沸10 min, 以增强蛋白质解聚变性 |
背景有白色/黑色斑点 |
转膜时有气泡或抗体分布不均 |
尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动 |
抗体与封闭剂结合 |
过滤封闭剂 |
暗片现白条带 |
一抗或二抗加入过多,导致高浓度HRP把底物消耗过快 |
稀释抗体的浓度 |
目的条带过低/过高 |
SDS-PAGE胶浓度选择不合适 |
调整胶浓度,分子量大的蛋白用低浓度胶,分子量小的蛋白用高浓度胶 |
“微笑”条带 |
迁移过快 |
降低电泳速度,低温电泳(冷室) |
电泳温度过高 |
条带拖尾 |
蛋白量太大 |
摸索最适蛋白量 |
一抗浓度太高 |
降低一抗浓度,减少孵育时间,同时洗涤时严格按照要求时间和次数进行 |
一抗孵育时间太长 |
出现重影 |
压片时,轻微移动了一段距离 |
X光片放上去之后,就不要动了,即使放歪了也没关系 |
出现非均一性背景 |
膜干燥 |
在每一步的操作过程中,都要注意不要让膜干燥 |
某个条带变形 |
凝胶中存在气泡或不溶性颗粒 |
配胶过程中要小心,使用无杂质的液体 |
条带呈哑铃状 |
凝胶配制不合格 |
充分混匀,防止胶凝固后不均一 |
拔梳子时要小心,避免胶孔变形 |
最边缘条带弯曲 |
电泳电流不均一 |
换用新的电泳槽 |
不使用两边的两孔 |
条带出现纵向条纹 |
样品中含有不溶性颗粒 |
去除样品中的不溶性颗粒 |
转膜不充分 |
膜没有完全均匀湿透 |
使用100% methanol浸透膜 |
靶蛋白分子量小于10,000 |
选择小孔径的膜,缩短转移时间 |
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 |
可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 |
甲醇浓度过高 |
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 |
转移时间不够 |
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 |
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