越来越流行的荧光免疫印迹(Fluorescent Western Blotting)

摘要

为何荧光免疫印迹(Fluorescent Western Blotting)越来越流行?

在化学发光印迹中,获得的信号是可变的,通常被认为是半定量的。然而,在荧光印迹中获得的信号是与荧光团结合的抗体复合物中靶蛋白的丰度成正比的静态值。下表列出了化学发光和荧光蛋白印迹之间的主要差异。

 

  化学发光检测 荧光检测
工作原理 酶标二抗 (e.g. HRP AP) 荧光二抗
检测方法 膜曝光(常见)

数字成像(少见)

数字成像

(激光扫描成像仪)

Multiplexing Capability No Yes
敏感性 +++ +++
信号稳定性 几个小时 几周到几个月
线性动态范围 15倍(薄膜检测)

3,000-4,000倍(数字成像仪)

>4,000
定量检测 酶信号可变,半定量 荧光信号是静态的,定量
底物 Luminol 不需底物

 

如上表所示,荧光蛋白印迹法使用用荧光团标记的二抗。只有当适当波长的光激发时,荧光团才会发光。因此,荧光印迹在重复实验中提供了定量和一致的结果。然而,可见荧光区域中相当大的膜自发荧光通常导致较低的信噪比。

此外,通常用于荧光信号检测的电荷耦合器件(CCD)照相机不能放大弱信号以检测低表达的蛋白质。这两个问题可能会限制荧光蛋白印迹的使用。

幸运的是,通过使用具有近红外(IR)染料的双色检测系统,克服了荧光蛋白印迹中缺乏敏感性的缺点。由于红外区域的背景荧光较低,红外荧光蛋白质印迹比使用可见荧光团的方案提供高达200倍的灵敏度。如下所述,这种增加的灵敏度提供了超过化学发光的蛋白质印迹的许多重要优点。

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红外荧光蛋白印迹的优点

1.比化学发光更灵敏

红外荧光印迹已被证明比化学发光印迹更敏感. 这是因为IR区域膜上的低背景荧光产生高的信噪比。配备有光电倍增管(PMT)的激光扫描成像仪对印迹进行成像,并可以将弱信号放大几个数量级

2.通过复用提高量化精度

使用双色检测方法可以同时检测相同印迹上的两种抗原。例如,您可以分析您感兴趣的蛋白,并利用内参蛋白(例如GAPDH,肌动蛋白)将其均一化,而无需剥离/重新检测印迹或运行单独的凝胶。因此,您的量化将更准确。

3.广泛的线性动态范围用于定量测量

为了确保可靠的定量测量,您从western blot获得的信号必须在线性动态范围内。这意味着信号强度与目标蛋白质丰度呈线性相关。换句话说,信号强度的两倍增加意味着目标蛋白质水平增加了两倍。通过激光成像仪获得的静态荧光值是定量的。这是因为荧光强度与几个数量级的蛋白质丰度成正比.这提供了广泛的线性范围。您可以在相同设置下量化低丰度和高丰度蛋白质,而不用担心信号饱和或超出线性范围。

相比之下,X射线胶片的动力学酶 - 底物反应和信号饱和将化学发光检测的线性度限制在更小的范围内。您经常需要尝试各种曝光以获得差异表达蛋白质的“正确图像”。这是为了确保捕获的信号在线性范围内.

4.一致性和可重复性 

荧光信号是仅取决于目标抗原的量的静态值,而许多变量影响通过膜曝光获得的化学发光信号。一些变量(例如,酶底物反应)难以控制导致不一致和不可重复的结果。 Schutz-geschwender等(2004)报道了荧光蛋白印迹实验重复的标准偏差远远小于化学发光检测。因此,为了确保您的免疫印迹结果的重复性和准确性。

5.扩展信号持续时间

荧光信号非常稳定。您可以将您的印迹存储在冰箱中,并在您准备好后再进行成像。相比之下,如果您正在进行化学发光的免疫印迹,您通常需要马上开始成像。这是为了避免酶活性降低。

期刊编辑和评论者越来越普遍要求定量的免疫印迹数据。另外,迫切需要提高科学界的蛋白质印迹重现性。正如本文中概述的,IR荧光法相对于化学发光的方法有许多优点。它不仅可以节省您的时间,而且还为您提供高品质,可发布和翔实的结果。还在踌躇犹豫,您不妨从使用如下产品开始,开启您的荧光免疫印迹之旅!

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