告别“黑白”,迎接“彩色”,荧光WB,你值得拥有

 

说起免疫印迹(Western Blot)检测,想必大家都很熟悉了,不就是WB吗?每天都做啊,白底黑带,但是最近经常阅读SCI文献(特别是高分的)小伙伴可能会发现,近两年发表很多高影响因子的文献的WB结果图发生了大变样:白底变成了黑底,条带从黑色变成了:红,橙,黄,绿,蓝等各种颜色了(如下),条带亮度,对比度都好了很多了,不同蛋白还能呈现出不同颜色的条带,很多同学可能会问,这是什么黑科技?是用分析软件设置的颜色吗?还是PS软件P出来的了?

 

免疫印迹检测

 

其实都不是,这是最近比较火的免疫印迹黑科技——荧光WB技术,这不,很多同学还在实验室中苦逼的跑着WB,“为啥背景那么深?为啥没有目的条带?为啥分子量不对?为什么对比度这么低?哀怨声此起彼伏的时候,殊不知,免疫印迹领域已经发生着一场由“黑白”到“彩色”的光影革命。

 

荧光WB产生背景:

 

尽管大多数生命科学研究者采用化学发光底物进行检测,但由于对多重分析的需求不断增加,现在越来越多的国外科学家开始使用荧光检测法。目前国内实验室使用较多的仍是化学发光,而SCI期刊中则有很多已经使用荧光标记WB了,为了紧跟时代的步伐,我们需要引进和创新。

 

常见Western Blot显色的方法主要有:放射自显影、底物化学发光ECL、底物DAB呈色,荧光WB实验步骤跟传统WB差异不大,最主要的差别在于二抗:传统WB检测二抗是酶标记,而荧光WB的二抗是荧光标记的,省去了繁杂的显影,照胶等步骤,取而代之的是利用荧光成像仪直接成像。

 

常规WB和荧光WB原理对比

常规WB和荧光WB原理对比

 

说了这么多,那荧光WB到底好在哪了?

 

荧光WB的优势:

 

化学发光的信号是动态的,二抗是酶标记,属于酶促动力学反应,信号随时间的变化而变化,信号不与目标蛋白浓度成线性比例关系。而荧光信号荧光是静态信号,不会随着时间的变化而变化,信号持久,可达到精准定量。

 

  1. 灵敏度更高

荧光免疫印迹已被证明比传统化学发光印迹更敏感,这是因为IR区域膜上的低背景荧光产生高的信噪比。配备有光电倍增管(PMT)的激光扫描成像仪对印迹进行成像,并可以将弱信号放大几个数量级。

 

  1. 通过复用提高量化精度

使用双色检测方法可以同时检测相同印迹上的两种抗原。例如,您可以分析您感兴趣的蛋白,并利用内参蛋白(例如GAPDH,肌动蛋白)将其均一化,而无需剥离/重新检测印迹或运行单独的凝胶。因此,您的量化将更准确。

 

双色检测

双色检测

 

  1. 广泛的线性动态范围用于定量测量

为了确保可靠的定量测量,您从western blot获得的信号必须在线性动态范围内。这意味着信号强度与目标蛋白质丰度呈线性相关。换句话说,信号强度的两倍增加意味着目标蛋白质水平增加了两倍。通过激光成像仪获得的静态荧光值是定量的。这是因为荧光强度与几个数量级的蛋白质丰度成正比。这提供了广泛的线性范围。您可以在相同设置下量化低丰度和高丰度蛋白质,而不用担心信号饱和或超出线性范围。

相比之下,X射线胶片的动力学酶-底物反应和信号饱和将化学发光检测的线性度限制在更小的范围内。您经常需要尝试各种曝光以获得差异表达蛋白质的“正确图像”。这是为了确保捕获的信号在线性范围内。

 

  1. 一致性和可重复性

荧光信号是仅取决于目标抗原的量的静态值,而许多变量影响通过膜曝光获得的化学发光信号。一些变量(例如,酶底物反应)难以控制导致不一致和不可重复的结果。 Schutz-geschwender等(2004)报道了荧光蛋白印迹实验重复的标准偏差远远小于化学发光检测。因此,为了确保您的免疫印迹结果的重复性和准确性。

 

  1. 信号持续时间

荧光信号非常稳定。您可以将您的印迹存储在冰箱中,并在您准备好后再进行成像。相比之下,如果您正在进行化学发光的免疫印迹,您通常需要马上开始成像。这是为了避免酶活性降低。

 

传统WB和荧光WB的综合比较:

化学发光法WB  荧光WB
信号源 酶促反应的间接信号(HRP酶标二抗+ECL显色) 荧光基团的直接信号(FITC/Dylight/Alexa Fluor荧光二抗)
信号持续时间 几分钟到几小时 几天到几周,避光保存得当可长达一年
灵敏度 高灵敏度,底物种类多样(DAB、ECL等)
例如ECL显色,HRP酶标二抗1:20000~1:50000
灵敏度较好
例如Dylight荧光二抗 1:10000左右
一致性 印迹间可能存在差异 印迹间的重复性较高
检测 胶片、化学发光法成像仪器
常见凝胶成像仪器均可
需有合适光源和滤光片的成像仪器,例如li-Cor、Bio-rad、天能等。
定量 定性及半定量,单通道检测使标准化较为困难 带有内部对照的多重分析技术使标准化较易实现
其他注意事项 相似分子量需要进行剥离和印迹的重新检测
曝光时间可以较长
需要注意避免荧光背景
由于少量的激发光会穿过滤光片,因此曝光时间更长会导致背景荧光较高
需要注意避光

 

话不多说,结果才是硬道理:

 

传统WB和荧光WB的综合比较

 

骨灰级传统WB玩家跑出来的条带应该也就左上角的水平了吧?相较于采用荧光WB随手一跑的结果(右上图和下图),如果你是审稿人,你会pick谁了?

 

小李子

 

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