髓过氧化物酶MPO检测的临床意义和方法

 

髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)又称过氧化物酶,是血红素辅基的血红素蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一。存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中,是髓细胞的特异性标志,随着对MPO研究的深入,人们发现MPO基因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异,与人类多种疾病的发生、发展密切相关,因此越来越受到国内外学者的重视。

 

髓过氧化物酶

 

MPO基因多态性

 

人髓过氧化物酶基因位于染色体17q23?q24,含有12个外显子和11个内含子,长约14 638 bp,调控其基因表达的是生长因子。MPO的mRNA在早幼粒细胞的表达水平最高,其次是原始粒细胞、幼稚和原始单核细胞;当细胞分化到成熟时期,MPO基因表达水平迅速下降。现已知MPO基因首先表达的是一条相对分子质量为89×103的前体蛋白(precursor protein),经过翻译后加工,切割成α和β两种亚基,再聚合为成熟的MPO分子,加上糖链,最后形成有功能的MPO。

 

MPO在基因表达过程中存在的缺陷,造成MPO基因DNA序列发生改变,影响其活力。MPO基因的多态性影响其基因的转录和表达,对机体的疾病易感性有一定的影响。Chevrier、unionluck 等发现了外显子11处和启动子区域的V53F、A332V、I642L和IVS11? 2A→C4个新的基因多态性位点,它们的作用与功能需要进一步研究。Piedrafita、unionluck 等研究发现与疾病有关的位点有5个:463G/A,R569W,Y173C,M251T和外显子9的碱基缺失。

 

研究最多的是MPO基因启动子区第463位核苷酸G/A的突变,该位点位于SP1转录因子识别结合的顺式作用元件中,内含4个Alu重复序列。G/A的突变导致位于Alu反应元件的SP1转录因子结合位点消失,从而使MPO转录水平显著下降。

 

unionluck也有报道发现外显子10的密码子569存在C被T替代,使CGG→TGG,导致遗传性MPO缺陷性疾病。还有研究报道在MPO基因129位点存在G被A取代,使MPO基因的表达水平显著降低。另外,据有关文献报道,MPO基因463A等位基因与一些癌症的风险降低相关。

 

MPO的生物学活性

 

MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志,其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞(PMN)的功能和活性状态。纯化的人MPO活性为25~35IU/mg,水溶性好,底物H2O2浓度>0.8mmol时酶受抑制,酶反应最佳pH为4.5~5.5,当pH≥10,或≤2时酶失活。

 

MPO的主要功能是在吞噬细胞内杀灭微生物,利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐,并形成具有氧化能力的自由基。构成MPO–H2O2–卤素系统。

 

unionluck研究发现,MPO不仅能杀灭吞噬于细胞内的微生物,而且可释放到细胞外,破坏多种靶物质,如肿瘤细胞、血小板、NK细胞、原虫、毒素等,对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用。然而,在特定条件下,MPO催化反应生成过量的氧化剂(HOCl、3–氯化酪氨酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等),超过局部抗氧化剂的防御反应时,就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。

 

MPO还参与调节炎症反应的许多过程,MPO缺陷的中性粒细胞因过量的注入炎症部位而发生氧化反应,大量的超氧化物和氧化物形成,造成炎症部位组织细胞损伤。此外还有协和洛克的学者发现MPO能与DNA牢固结合形成复合物,有效保护DNA防止其在氧化过程中受损,从而保证髓系细胞的正常分化成熟及功能。

 

嗜中性粒细胞是粒状白血细胞,在寄主防卫以及噬菌作用破坏感染性细菌的过程中起着重要作用。教科书上关于嗜中性粒细胞功能的模型是这样的:将毒性过氧化物释放进含有被摄取的微生物的小囊中,接下来是由髓过氧化物酶催化的卤化作用。

 

MPO相关疾病

 

1.MPO与心血管疾病

 

1)MPO与冠状动脉疾病。冠心病是心血管系统中最常见的疾病,而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。AS发病过程中通常出现氧化低密度脂蛋白,进而巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞,泡沫细胞的形成在AS的发生机制中起关键作用。协和洛克研究发现MPO有促进AS病变形成的作用,MPO通过产生自由基和多种反应性物质,促进斑块形成和不稳定性增加,加速AS进展,进而引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。研究发现,MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关,还可以预测早期患心肌梗死的危险性。

 

MPO与心血管疾病

髓过氧化物酶的影响

 

2)MPO与急性冠脉综合征(ACS)。MPO促进ACS病变形成,并影响粥样斑块的稳定性,通过增大氧化应激而引起ACS。研究表明,MPO是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子,特别是在肌钙蛋白T(TnT)水平较低的患者,MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者。

 

2.MPO与肿瘤

 

1)MPO与肺癌。在肺部受微生物侵袭、职业暴露以及吸烟时,MPO会随中性粒细胞的聚集释放到炎症部位。MPO可代谢激活多种与肺癌有关的环境致癌物,能将前致癌物如多环芳烃类的苯并芘(BaP)转化成具有高度反应性和致癌性的活性产物二醇环氧化苯并芘(BPDE),BPDE能与DNA形成加合物并导致姐妹染色体互换,从而导致肺癌。

 

2)MPO与白血病白血病是累及造血干细胞的造血系统恶性肿瘤,其病因尚不完全清楚。

 

3.MPO与地方性砷中毒

 

随着分子生物学领域的不断发展,发现MPO在砷中毒所致皮肤病变的发生发展中起着重要作用。MPO被研究者认为可能是砷中毒新发现的一种易感标志物,将在慢性砷中毒的早期诊断和危险评估中具有重要的意义,但国内就这方面的研究还没有涉及到,国外对其深入的影响机制的研究也不是很多,因此还很难在现有的研究基础上建立起砷中毒易感性与MPO及其多态性的明确关系,还需要进一步的研究证实。

 

4.MPO与其他疾病

 

MPO在现阶段的研究也确定了它在疾病早期诊断与危险评估中具有重要的意义。MPO通过不同的途径可导致某些疾病,同时其基因多态性也会降低机体对某些疾病的易感受性,从而对机体产生保护作用,但其作用机制仍不清楚,随着分子生物学领域的不断发展,MPO的作用机制研究将不断深入,可能会发现其他一些与疾病易感性有关的多态性位点,从而使人们更清楚的认识其相关疾病的发生、发展,以便对这些人群采取有效的预防和治疗措施。

 

MPO的临床意义

 

1.大量文献数据表明,MPO可作为冠心病的预测因子和急性冠脉综合征预后判断指标:MPO升高提示患者存在冠状动脉炎症,斑块不稳定,但血管未完全堵塞,并未引起心肌坏死,所以MPO可早期识别不稳定斑块,是ACS早期诊断的炎症标记物之一。

 

2.MPO作为一种新的预测ACS的炎症标志物,能识别心肌肌钙蛋白T(cTnT)阴性的ACS患者未来发生不良心血管事件的危险性。

 

3.国外文献指出,MPO基线水平能独立预测其未来30天到6个月内突发心脏不良事件(心肌梗死、再梗死、血管重建或死亡)的危险性。

 

4.MPO能识别低水平C反应蛋白(CRP阴性)的ACS预后不良患者。

 

5.预测35岁以上健康人群未来发生心血管疾病的风险。MPO可独立预测健康人未来患心血管疾病的风险,而不依赖C-反应蛋白和其他炎症标记物。

 

权威杂志新英格兰医学期刊在2003年报道了一项研究,通过检测604名胸痛患者的MPO浓度水平,能预测30天至6个月内发生心血管事件的概率。如果单独检测cTnT,只有54%的患者被预测,而采用检测MPO预测出的概率提高到84.5%。

 

MPO的检测方法

 

1.连续监测法

 

在酸性条件下,以四甲基联苯胺、邻甲氧基苯酚或3,3′-二甲氧基联苯胺为底物,测定血液或组织中MPO活性。Bradley等建立一种测定MPO活性的方法:在pH6.0的条件下,以H2O2及3,3′-二甲氧基联苯胺盐酸盐为底物,MPO催化底物生成桔黄色产物,在460nm波长处连续监测,吸光度的增高速率与MPO的活性成正比。1U的PO指在25℃1min内转化1μmolH2O2所需MPO量。这种方法具有快速、灵敏、成本低等特点,但易受其他过氧化物酶(例如嗜酸性粒细胞过氧化物酶)和某些血红素蛋白(例如血红蛋白、肌红蛋白)的干扰。

 

  1.  酶联免疫吸附法(ELISA)

 

利用MPO抗原性制备特异抗体,通过免疫学方法直接测定血液中酶的蛋白质含量。此方法灵敏度高,可达到ng/ml水平;特异性较高,几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响,也不受过氧化物酶和血红素蛋白干扰。由于需要制备高效价抗体,成本较高,并且测定时间较长,因此,目前此法多用于科研领域。Chang等采用ELISA方法测定血浆中MPO浓度,建立中国人MPO正常参考值范围(14.8~77.1ng/ml),未发现MPO在不同性别及年龄组存在统计学差异。

 

  1.  流式细胞仪测定法

 

测定中性粒细胞胞浆中MPO的含量。将全血加入红细胞溶解液中,后使用固定液及细胞膜渗透剂处理细胞,最后加入荧光素(例如藻红蛋白)标记的抗MPO单克隆抗体,利用抗原抗体反应对MPO染色,对特定细胞群体设门进行流式细胞分析,分析出门内MPO阳性细胞比例和平均荧光强度。此方法特异性强、灵敏度高,但是技术程序比较复杂,需使用特殊仪器。

 

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