透析袋的使用方法详解!

透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。那透析袋是怎样使用的呢?

 

1、透析的原理

透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,将此透析袋浸入水或缓冲液中,样品溶液中大分子量的生物分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。

透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,还正比于膜的面积和温度,通常是4℃透析,升高温度可加快透析速度。

 

2、透析袋的材质与规格

透析膜可用动物膜和玻璃纸等,但用的最多的还是用纤维素(再生纤维素 RC、纤维素酯CE、PVDF等)制成的透析膜,目前常用的是美国光谱医学公司(spectrum)和美国联合碳化物公司(union carbide)生产的各种尺寸的透析管。截留分子量MwCO(即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量,缩写为MwCO)大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等种类,单位为道尔顿(D)。截留分子量越大也就是说透过性越大,一般而言,透析袋截留分子量越小价格越贵,因为截留的分子越小要求透析袋越密,价格越贵。商品透析袋制成管状,其扁平宽度为8mm-77mm不等。

半透膜制成的透析袋作为工具,存在透析时间长、样品回收率不高、无法处理微量样品的难题。目前已有专为10到100ul的微量样品透析而设计的透析工具。把样品加在平底的透析管(类似小量提质粒的离心纯化柱,可以插入1.5ml的离心管中,管底是半透膜)中,再插入特制的浮板(浮漂)中,置于缓冲液面10min即完成透析。实验表明,100ul pH2.8的IgG洗脱液在1L pH9.4的缓冲液中只需不到10min即可平衡到pH9.4。如果在装缓冲液的烧杯底加磁力棒搅拌则更能加速透析速度。这种方法有较高的回收率,能够节约珍贵的样品,并能节约时间,特别适合摸条件的预实验。

透析袋的标识:

27mm(MD34)透析袋(MW:3500)

27mm是指透析袋干燥时的直径。

MD34mm是指透析袋干燥时压平的宽度。

MW:3500是指透析袋的截留分子量。

 

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3、透析袋的选择

1)选择合适的截留分子量。

截留分子量的选择是以预留在膜内的大分子的分子量和将要被除去的小分子污染物的分子量为基础的。为达到合理有效的分离,需分离的两种物质分子量的比率至少为25。选择截留分子量的经验法则:选择截留分子量值约为要保留的大分子分子量的一半,以获得至少90%的保留率。

分子量差超过100倍时,可以同时保证高收率和高纯度。

当分子量差10倍时,为了追求高收率,可以选择较低的截留分子量;为了追求高纯度,可以选择较高的截留分子量。如产品(Cyt C,20KD)和杂质(Vit B12,2KD),侧重收率,选择截留分子是产品分子量的80%-100%及提高收率,用截留分子量20KD的膜去分离Cyt C和Vit B12可得到约88%左右的收率,但仍含有12%左右的杂质。侧重纯度但牺牲收率,选用截留分子量高一些膜,样品保留率在50%-80%左右,用截留分子量为50KD的膜去分离Cyt C和Vit B12以达到收率76%左右和约有2%的B12存留。

对于需对几种分子进行分离的应用,分子之间的分子量差至少为5倍,才能完成有效的膜透析。若不能满足分子量差的要求,可能需要使用其它的分离技术,如色谱方法或切向流过滤。

2)选择适当的扁平宽度(体积)

透析袋扁平宽度的选择取决于样品体积和透析容量。较小的透析管透析更快;较大的透析管因扩散距离较长透析较慢。为易于使用,建议使用总长(包括闭合夹和顶部空间)为大约10-15cm的透析袋。

3)选择适合的透析膜材质

每种膜对不同的分子具有不同的亲和性。对于球蛋白,相对的结合亲和性由低到高为CE<RC<PVDF。

 

4、透析袋使用前的处理

为防干裂,出厂前透析袋一般都经10%的甘油处理,透析袋中含有微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质,它们对蛋白质和其他生物活性物质有害,用前必须除去。新购进的普通型透析袋必须经过处理才能使用。处理方法如下。

方法一:

  • 把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。
  • 在大体积(500ml)的2%(w/v)的碳酸氢钠和1mmol/L EDTA2Na(pH=8.0)中将透析袋煮沸10min。
  • 用蒸馏水彻底清洗透析袋。
  • 放在500ml的1mmol/L EDTA2Na(pH=8.0)中将之煮沸10min。
  • 冷却后,置于30%或者50%的酒精中,放于4℃冰箱,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时其取用透析袋必须戴手套。
  • 在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗干净。

方法二:

可先用50%乙醇煮沸1h,再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH=8.0)溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗即可使用。

方法三:

实验要求不高的可以用简易方法处理。用沸水煮5至10min,再用蒸馏水洗净,即可使用。

不过现在也有杂质含量极少,无需预处理,只需用去离子水清洗即可使用的即用型透析袋。这种透析袋具有特殊的生物技术膜,不含硫化物及金属杂质。只是比普通型透析袋稍贵。

 

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5、透析的过程

1)把适量的透析液(缓冲液)加入透析装置。透析液的体积应为样品体积量的100倍。(例如,在1L透析液中透析10ml的样品)

2)裁剪适当长度的透析管。预留一段额外长度(约占总样品体积量的20%)作为头部空间。

3)把透析管插入打开的透析夹,在约超出透析夹3-5mm的位置再夹住。不要折叠透析袋。

4)由透析管开口端将样品装入。调整一下顶部空间的长度,夹紧透析夹。

5)把透析样品放在合适的透析缓冲液中。

6)透析要根据具体的应用需求。通常情况下,允许过夜透析。在持续透析的过程中,至少要进行3次全部更换透析液。建议在(透析后)2-4小时,6-8小时和10-14小时(第二天早晨)更换透析液。在最后一次透析液的更换后,要至少继续进行2小时的透析。

注意:对于高浓度污染物,样品可能需要较长的时间透析,透析液需要更频繁的更换。

7)透析温度主要取决于样品。温度最高限制主要取决于膜的类型。纤维素透析袋可以承受的温度高达37℃。再生纤维素透析袋可以承受的温度高达60℃。

 

6、透析袋的存储

1)在适当的储存条件下,保质期一般在两年以上。干燥的透析袋要在室温或4℃储存在聚乙烯袋中。未开封的透析袋4℃储存。

2)透析袋一旦变湿,应浸泡在溶液中,不要让透析袋干燥。不断干燥会造成孔隙结构不可恢复的倒塌。

3)使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水或者30%乙醇中,确保透析袋始终浸没在溶液内。若长时间不用,可加少量NaN2,以防长菌。从此时起取用透析袋必须戴手套。

 

7、透析袋浓缩样品

大多数情况下,透析袋纯化的样品会被稀释。如果下游需要的样品浓度比较高时,可能需要对样品进行浓缩。透析袋本身浓缩的方法如下。

1)吹干浓缩法:将蛋白溶液装入透析袋内,放在电风扇下吹。此法简单,但速度慢,且温度不能过高,最好不要超过15℃。

2)透析袋浓缩法:利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替),结扎,把高分子(6000-12000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液,将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后,可放入温箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。

主要用于更换蛋白质的缓冲液,得有透析袋。不需要特殊的仪器。一般用得是PEG20000进行实验,简单,快速,对蛋白没什么影响。

此外,还有其他的样品浓缩方法,如冷冻干燥浓缩法、超滤膜浓缩法等。

 

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