全套病毒RNA m6A甲基化修饰研究工具来了！

 

如果新冠病毒SARS-CoV-2的大流行对我们有任何启发的话，那么要数对RNA修饰的研究了，此时研究病毒RNA以及其甲基化修饰等功能，显得比以往任何时候都更加重要。 而这是否意味着要研究病毒RNA本身不同的各种突变体或者表观遗传变化如何使这些病毒更灵活和感染力？还是研究从细胞和组织中收集的RNA是怎么对宿主细胞功能的产生影响和致病的？然后，现实告诉我们，这项研究工作几乎是无止境的。

 

通常，设置实验中最具挑战性的部分之一是每一步实验操作的处理方式。 为了向您提供表观遗传研究的完整解决方案，EpiGentek以试剂盒和信息的形式提供了全套病毒RNA修饰研究的工作流程解决方案，如下图。

 

 

首先我们了解一下研究背景：

 

m6A RNA甲基化和去甲基化循环

 

m6A RNA的形成是由多蛋白质甲基转移酶复合物调控的，部分由METTL酶调控。最近的研究发现，在哺乳动物中存在这些甲基化酶“写入者”及其相关的去甲基酶“擦除者”，揭示出 RNA m6A甲基化修饰是可逆的，如下图所示。 一个甲基通过METTL3 / 14异二聚体以化学方法加入到腺苷（A）残基的氮6位上，形成了N6-甲基腺苷（m6A）。 然后，m6A可以通过FTO介导的氧化脱甲基作用，逐步转化为N6-羟甲基腺苷（hm6A），随后转化为N6-甲酰腺苷（f6A），最后最终还原为原始腺苷酸（A）。

 

 

m6A修饰对RNA病毒生命周期的影响

 

已知表观遗传修饰会影响人类冠状病毒等RNA病毒的生命周期。据报道，像N6-甲基腺苷（m6A）这样的腺苷甲基化修饰可通过调节病毒帽结构，病毒基因表达，病毒传代，先天传感途径和先天免疫应答来影响某些RNA病毒的生存能力。 m6A的获得或丧失可导致RNA病毒发生重大功能变化，从而改变其宿主细胞的融合/进入，复制，传播，致病强度和免疫逃逸。宿主细胞的m6A转录组在宿主抵抗性能中起作用，在病毒感染后也可能因此而发生改变。

 

新冠病毒SARS-CoV-2基因组的长度超过29,800个核苷酸，包含50多个潜在的m6A位点，这些甲基化位点的碱基是RNA甲基化酶复合体METTL3 / 14修饰的m6A特定碱基，包括GGACU（T），GGACA ，以及GGACC。因此，新冠病毒SARS-CoV-2 RNA中所有腺苷中有大于 0.64％，或大于0.18％的所有碱基都可能是m6A修饰的。因此，总RNA中的m6A定量和整个转录组的m6A定位对于研究与m6A相关的病毒功能和相应的机制以及确定抗病毒治疗的新靶标至关重要。

 

那么，病毒RNA修饰的研究工作流程有哪些呢？

 

首先，提取病毒RNA

 

无论您是从细胞，组织还是病毒等样品开始实验，高效而快速的RNA提取通常都是成功进行实验的第一步。工作流程的这一部分至关重要，因为足够的纯度和产量都是确保下游应用程序平稳准确运行的基本要求。

 

而同时，在选择试剂盒的时候，要注意的是， 我们需要根据样本类型来挑选：

 

1）病毒样本：对于病毒样品，诸如低病毒滴度和高污染宿主核酸的存在等挑战要求使用补充技术来确保产量和纯度符合下游实验的要求。在我们最近的公告文章中，我们概述了完成此操作的10种方法，因此您可以将其应用到最适合您的学习的方法中。实现病毒扩增的常用方法是：接种病毒至宿主细胞，扩大培养宿主细胞进行病毒扩增，然后收集扩增的病毒体，搭配EpiGentek的病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。注意：对于直接从临床标本中提取的病毒RNA，在m6A RNA富集之前，需要去除宿主DNA和rRNA污染物。

 

2）细胞/组织样本：不需要特别处理；由于可以从细胞和组织样品中获取大量丰富的RNA，因此不需要太多额外的处理就可以获得足够下游应用的RNA样本。我们建议使用EpiGentek总RNA快速提取试剂盒或EpiQuik 磁珠法快速RNA提取试剂盒。

 

病毒RNA提取试剂盒

 

总RNA提取试剂盒

 

细胞核提取试剂盒

 

当处理细胞或组织样本时，核提取的阶段很重要。而核提取物将最终进行甲基酶或脱甲基酶活性/抑制作用的分析。 在这一步骤中，EpiQuik 核提取试剂盒可以用预裂解和裂解缓冲液处理细胞/组织，分别破坏细胞膜和核膜，并提取核蛋白以用于下游实验。 我们的专有试剂盒含有所有核提取的试剂，可1小时的快速提取核蛋白，并可以保持完整的酶活性。

 

 

RNA甲基化是一种可逆的翻译后修饰，它在表观遗传上影响许多生物学过程，这些过程可能同时发生在病毒和非病毒来源的RNA中。其中最常见的是m6A甲基化，占所有RNA甲基化的80％以上，其次是5-mC甲基化，这可能发生在各种RNA分子中。如果您打算研究RNA中m6A或5-mC的总体甲基化水平，下表中的比色和荧光法试剂盒将会帮您快速，准确的定量。但是如果您的起始样本是病毒，那么可能您还需要先富集和纯化病毒以提高病毒RNA的产量，以适应下游实验。因为通常情况下，因为从病毒原料中收集到的少量RNA太少而无法在下游使用。我们建议参考我们最近的文章关于关各种病毒纯化方法以获取足够的病毒RNA量。

 

m6A RNA 甲基化定量试剂盒产品表：

  

随后, 需要检测m6A甲基化酶和脱甲基酶活性

 

如果您打算研究RNA甲基化酶或去甲基化酶的活性/抑制作用，我们建议您使用上述提到的功能强大的核提取试剂盒（OP-0002），该试剂盒可以快速提取核蛋白，同时可确保提取后的酶活性保持完整。

 

收集了核提取物后，进行甲基化酶或脱甲基酶活性/抑制作用的测定，我们推荐经过优化的基于ELISA法的去甲基化或者甲基化酶活性检测试剂盒，该试剂盒可以对样品进行高通量分析，并经过优化以保证较低的信噪比，测量准确可靠。

 

或许还需要m6A 抗体研究病毒的发展和疾病的影响：

 

如前所述，m6A是最丰富的mRNA修饰，通常是研究表观遗传RNA修饰的研究人员感兴趣的主题。 因此，此类研究通常需要单克隆抗体和多克隆抗体，以验证结果并帮助了解一旦宿主感染后这种特定修饰如何影响病毒的发展和疾病的影响。 我们的抗体已验证了多种应用，如下列表，并提供小包装供广大研究者试用。

 

 

进一步的了解RNA甲基化，也许您还需要对其富集和测序：

一旦工作流程中的其他步骤完成，那么接下来就是富集m6A的基因组片段，并通过构建文库为下一代基因测序做准备。 下面列出的是富集m6A RNA的试剂盒，以及构建文库的RNA m6A测序试剂盒。

 

 

 

 

 

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