非内源性蛋白的相互作用, 主要是通过过表达来实现,通常为简化实验、提高 IP 效率会让外源蛋白带上标签。因此,就 tag 的使用而言存在很多小技巧。
1、 His-tagged 主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用 His-tagged 蛋白然后进行 coIP,实际上它存在潜在的隐患。因为很多蛋白会有富含 histidine 的 domain,恰恰是因为效价非常好,所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理,如果用 Ni-NTA beads 去 PD(pull down) His-tagged 的蛋白,完全有可能 PD 那些内源性的富含 histidine domain 的蛋白,造成 coIP 的假象,而这样的蛋白还非常多。
2、tandem-tagged 不能用于分析钙调信号通路。 tandem tag 实际上从成本角度 和 His tag 差不多,洗脱试剂价格低廉,因此可用于大规模 PD 之后的质谱分析, 能获取最全面的相互作用的信息。然而由于其中包含钙调蛋白相互作用 domain, 天然会结合钙信号相关蛋白,从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用,有一定的应用局限。
3、Myc、HA、Flag-tagged: Myc 仍然会有天然的干扰,应用略有局限;相较后两者是人工合成专门用于 tagged 蛋白(有相应的专利,因此目前无论抗体或交联好的 beads 价格都非常昂贵),因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分,a-Flag 效价比 a-HA 略高,因此更适合IP。
4、tag 的位置。将 tag 构建到蛋白的 N 端还是 C 端,也是一个潜在的能够影响 coIP 结果的因素。比如,分泌蛋白的 N 端通常有分泌信号肽,如果将 tag 构建 到 N 端,则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除;所以这时必须构建在 C 端。再如,多数蛋白的 C 端是疏水区,有的时候将 tag 构建在 C 端会影响蛋白原来的空间结构,如恰好 C 端同时是相互作用的结构域,某些时候还可能被遮 蔽,从而干扰相互作用。因此,通常构建质粒的时候是 N 端、C 端 tagged 同时分别构建,以备万一。
5、 IP 外源 tagged-A 蛋白,洗脱尽量用相应的 多肽,一方面提高特异性,另 一方面由于洗脱条件温和,重链和轻链脱落也会较少; 在 IP 前, 尤其对于新 Flag、 HA beads 可以用 washing buffer 或者低 pH Glycine-HCl 漂洗一下 beads, 把结合不牢的重链和轻链先洗掉。此外,Flag、HA-beads 通常是鼠抗,那么 IB B 蛋白的抗体应该选用兔抗。
6、 IP 内源性蛋白,尤其最后涉及低 pH Glycine-HCl 洗脱或者 SDS LB 煮 beads (后者重、轻链更严重),如 B 蛋白为 60KDa 即能与 55KDa 重链分开时,且抗体效价许可的前提下,降低抗体投入量会显著减弱重、轻链信号,从而不会使得 B 蛋白信号不致被重链信号吞没; 若有条件再配合交错抗体种属来源, 即 IP A 蛋白的抗体为兔抗,IB B 蛋白用兔抗以外任何一种诸如鼠抗、羊抗;反之亦然。
7、即使交错抗体的种属,实际上当重轻链脱落过多时(尤其是重链),在 IP 的时候它符合《WB 实战指南》提到的杂蛋白过浓会非特异结合任意抗体,这在 coIP 的实验结果分析中要格外小心。有人会说可以用未免疫的 IgG 做阴性对照,但 是偶尔会发生一些未知意外,恰好 IgG 的重链没有显影(毕竟这不是抗原抗体 特异性结合)。