串联染料在流式细胞术(FCM)使用中的利与弊!

摘要

串联染料在流式细胞术(FCM)使用有很多优点,当然也有不足之处。下面将串联染料优点缺点小编全都写在这里,拿走不谢。

流式细胞术在细胞分子水平上对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析,高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准确性好的优点,越来越受到科研工作者的青睐。

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今天,小编和大家一起讨论下流式细胞术(FCM)使用过程中的一个元素:荧光染料之串联染料的使用。

 

我们知道当光被电激发的分子吸收时,荧光起作用,当分子返回到其基态时,光能被释放。发射光具有比激发光更长的波长和更少的能量。激发和发射波长之间的差异称为“斯托克斯频移”。当您选择用于流式细胞术的荧光团时,您希望具有尽可能大的斯托克斯频移,因为这意味着发射的光将可以与激发光源可靠地区分开。

 

为了利用这个概念,科学家开发了串联染料。串联染料(或荧光团)由两个共价连接的荧光分子组成。一个用作供体分子,而另一个用作受体。这产生了具有供体分子的激发和受体的发射性质的独特荧光团。这个开发的实现依赖Förster/荧光共振能量转移(FRET)的现象,荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。

 

当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即FRET现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。常见的串联染料有:

 

  1. Phycoerythrin-Texas Red-X,又称PE-Texas Red或ECD(488nm激发,606-635nm发射);
  2. Phycoerythrin-Cyanin 5.5,又称 PE-Cy5.5或PC5.5(488nm激发,680-710nm发射);
  3. Phycoerythrin-Cyanin 7,又称PE-Cy7或PC7(488nm激发,>755nm发射)。
  4. Allophycocyanin-Alexa700,又称APC-A700(633nm激发,715-735nm发射);
  5. Allophycocyanin-H7,又称APC-H7(633nm激发,785nm发射)。

 

使用串联染料时需注意:

虽然串联染料对于流式细胞术非常重要和有用,但它们不是没有限制。最大问题是串联染料是非常敏感和容易降解。这导致受体发射光损失和供体发射光增强,特别是如果荧光团使用相同激光器激发。例如,如果使用PE和PE-Cy7,并且PE-Cy7荧光团开始降解,则其发射的光将在PE通道中检测到,从而给导致错误的数据。串联染料降解的主要原因之一(除了氧自由基)是暴露于光 - 这是完全可预防的!所以,当染色细胞时,避免曝光或处于极端的温度变化环境。后一种建议的原因是某些串联染料可能易受细胞介导的解耦影响,因此在低温下减慢细胞代谢可有助于保持稳定性。

 

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