精子质量检测是诊断男性不育的重要手段，精液的常规分析费时费力，检测指标单一，只能反映精子的形态特征和有限的功能，无法准确且全面的反映精子质量。
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。将FCM用于精液检查，可把定性的描述过渡到定量的研究，并可进行数据统计，大大提高了实验结果的科学性，而且可对精液进行高通量、多参数分析，能极大的拓展精子学这个生殖方面的子领域。
流式细胞术研究专家EXBIO可提供流式细胞术精液检测分析试剂盒，从精液的多参数角度评估精子的质量：
| 货号 | ED7079 |
| 规格 | 25 tests |
| 名称 | SpermFlowEx Kit，基于流式细胞术精液检测分析试剂盒 |
| 说明 | 基于流式细胞仪分析人精液中的以下参数： 精子计数； 白细胞计数； 精子存活率； 精子顶体完整性； 精子中顶端体蛋白； （应根据WHO的建议，使用光学显微镜检查精子活力和形态） |
| 组分 | 1. Intra-acrosomal protein FITC, 0.5 ml（货号：ED7079-1） 2. CD45 PE-Cy5, 0.25 ml（货号：ED7079-2） 3. Fluorescent Count Standard, 2.0 ml（货号：ED7079-3） 4. Propidium Iodide, 0.25 ml（货号：ED7079-4） 5. Permeabilizing Solution, 25 ml（货号：ED7079-5） |
| 说明书 | 下载 |
| 产品图 |  |
基于该试剂盒，各指标参数的处理与分析如下：
（一）精液中精子及白细胞计数
白细胞是精液中常见的一种细胞。白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧，分泌一些细胞因子等途径诱导细胞凋亡，导致精子数量减少。研究发现，白细胞计数增高与精子参数(包括密度)的降低存在明显相关性。FCM检测是根据白细胞所表达的共同抗原，用结合荧光染料的单克隆抗体CD45标记白细胞进行检测，相比于直接镜检、过氧化物酶染色等其他检测手段，FCM可准确区分白细胞与生精细胞，操作简便，结果可靠，且可进一步区分白细胞各亚群。
操作步骤：
- 吸取50ul稀释好的精液至试管中
- 加10ul CD45 PE-Cy5抗体溶液
- 混合样品，在室温下孵育20分钟
- 加50ul荧光计数标准液（首先，将标准液混合均匀，加几滴到干净的微管中，然后用移液器从微管中吸取精准体积的标准液加到精子样本管）
- 加5ml PBS，混合后上流式细胞仪
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| 1.精液中精子计数 | 2.精液中白细胞计数 |
| 将测量数据可视化为点图，其中FITC荧光强度在X轴上，前向散射（FSC）在Y轴上。 如图所示设置门：门A：所有细胞，门B：精子，门C：荧光计数标准品（荧光微珠） | 将门A可视化为点图，其中X轴表示PE-Cy™5染料的荧光强度，Y轴表示侧向散射（SSC）。与精子相反，白细胞是CD45阳性。 使用门D区分白细胞。 |
使用以下公式进行精子和白细胞的计数:
S：精液中的精子数
L：精液中的白细胞数
Gate B: B门中的event count值
Gate C: C门中的event count值
Gate D: D门中的event count值
（二）精子存活率
PI (碘化丙啶, Propidium Iodide)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，只有没有活力的精子才会被碘化丙啶溶液染色。因此用FCM结合DNA荧光染料PI，可以反映出精子的存活率。
操作步骤：
- 吸取50ul稀释好的精液至试管中
- 加10ul PI溶液
- 混合均匀，在室温下孵育20分钟
- 加0.5mlPBS，混合后上流式细胞仪
结果
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| 3.精子细胞设门 | 4.精子存活率 |
将测量数据可视化为前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）点图。 如图3所示，在精子细胞周围设门。然后在直方图中可视化精子细胞（图4），其中X轴表示PE-Cy5或PerCP通道中碘化丙啶的荧光强度。使用适当的门分离阳性和阴性精子细胞。 阴性群体代表有活力的精子，而PI阳性群体则代表无活力的精子。 精子的生存率由所有精子细胞中有活力的精子的百分比表示。
（三）顶体完整性和顶端体蛋白的存在
在受精过程中，哺乳动物刚射出的精子在体内要经过获能和顶体反应，才能穿入卵细胞并与其融合，完成受精。因此检测精子的顶体状态，有助于反映精子的受精能力。精子顶端体蛋白（intra-acrosomal protein），是一种在成熟精子的顶体膜上特异性表达的蛋白，该蛋白在几乎所有人类精子样本中都能被检测到，且表达量稳定。利用标记了FITC荧光素的顶端体蛋白抗体，特异性地标记在顶体膜上，其荧光强度可反映顶体大小，因此通过测定荧光强度可间接反映顶体结构的完整性。
操作步骤-顶体的完整性
- 吸取50ul稀释好的精液至试管中
- 加1 ml PBS，混合后，150 g离心5分钟，去上清
- 再洗一次（重复步骤2）
- 向沉淀中加10ul Intra-acrosomal protein FITC抗体
- 混合均匀，在室温下孵育20分钟
- 加0.5mlPBS，混合后上流式细胞仪
操作步骤-是否存在Intra-acrosomal protein（需透化）
- 吸取50ul稀释好的精液至试管中
- 加1 ml渗透液
- 混合均匀，室温下孵育15分钟
- 150 g离心5分钟，去上清液
- 向沉淀物中加入1 ml PBS，混合均匀，以150 g离心5分钟
- 再洗一次（重复步骤5）
- 加入10 ul Intra-acrosomal protein FITC抗体
- 充分混匀，室温下孵育20分钟
- 加5mlPBS，混合后上流式细胞仪
结果
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| 5.非透化，非病理性精子 | 6.透化的非病理性精子 | 7.非透化病理性精子 |
可视化抗体（顶端体蛋白FITC）对可渗透和未渗透样品染色的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）点图，并在精子周围设门，如图3所示。然后在直方图中可视化精子事件（见图5-7），其中X轴表示荧光强度 在FITC荧光检测器中。 使用适当的门将阳性和阴性精子分开。 图5显示了阳性精子含量低（<30％）的未透化非病理性精子事件。 阴性代表具有完整顶体的精子，阳性代表具有受损的顶体的精子。图6显示了渗透性非病理性精子，其中阳性精子占主导地位。 阳性精子表明存在顶端体蛋白。图7显示了未渗透的病理性精子，其中顶体受损的阳性精子的含量高（> 30％）。
EXBIO是捷克一家著名的生物试剂公司，专注于流式细胞术配套试剂的开发。自1990年成立以来，EXBIO公司研发和制造的抗体分销全球。目前，EXBIO可提供超过4000种质优、价廉的研究和临床应用抗体，涵盖了血液学，免疫学，癌症，干细胞和细胞生物学等领域，如：CD分子、细胞粘附分子、细胞骨架、凋亡、细胞信号传导、肿瘤标志物、人血型、HLA、生殖等研究用抗体，涉及荧光染料如FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、APC、PerCP、PerCP-Cy5.5、Pacific Blue、Pacific Orange、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、Biotin等多达13种，满足客户各类实验需求。
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