如何收集和保存外泌体样本?

Exosome样本是进行有关外泌体的实验的基础,很多童靴认为这是最简单的。如果你真的这么认为,那么就大错特错了。收集样本有不同的要求,一个比一个重要。那该如何去选择我们的实验样本?取样的时候又该注意些什么?分离好后的外泌体又如何保存呢?

 

Exosome
  一、外泌体样本的选择和注意事项

 

实验样本不同在收集的时候需要注意的点不同。你研究的是哪种样本,需要特别注意哪些方面呢?看以下阐述:

 

1、细胞上清

选用细胞培养上清作为分离外泌体的实验材料不会像血样等存在样本量限制的问题,而且操作简单,直接离心即可。但在细胞培养过程中需注意污染、培养时间、细胞死亡率及FBS的问题。和所有的细胞实验一样,培养过程中不允许有污染,但有些培养细胞本身带有病毒基因组,在培养过程中会释放出病毒颗粒,这就要衡量病毒颗粒是否会影响后续实验。

 

一般培养24-48h后细胞即可分离外泌体,在特殊情况下,如在培养基中添加特殊的化学物质,培养15-60min即可收集。因细胞死亡会分泌小体,所以在研究外泌体时细胞的死亡率一定要控制 5% 之内。未经处理的FBS中含有大量的外源外泌体,所以细胞培养一定要用经过处理不含外泌体的FBS。

 

2、唾液

唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同,所以同血样一样需定点定时。唾液主要由舌下腺,颌下腺及腮腺3个腺体分泌,所以不同位置的唾液成分不同,在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液。不同时间段的唾液成分也会不一样,所以也需定时取。其他如吸烟进食都是禁止的,一般建议采样1h之内不能有进食行为,包括饮料,且不要剧烈运动,在平息状态下取样。最后一点,不能刷牙。

 

3、血液

在第一次外泌体课程的时候,就有许多同学问到关于血清和血浆选择的问题,那到底应该选哪个呢?血浆=血液-血细胞 血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子

分不清楚两者的弄清血清的来源就能牢牢记住啦。血清是血液凝固之后收集的液体,所以其中少了纤维蛋白原,凝血因子,以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白,具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体,有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。所以一般实验选择血浆,在特殊情况下,如研究与血小板相关的疾病的时候,当然是血清更适合。

受限于样本,血样一般取2ml。那取血样的时候有什么注意的地方呢?在外泌体的血样研究中,经常被忽略的一个问题就是针头的大小。在抽血过程中,血液流经针头的时候会产生剪切力,若针头太细,剪切力较大,会使细胞破碎或刺激血小板分泌外泌体,从而影响后续的实验。有些文献报道21号针头的大小比较合适作为外泌体研究的血样收集。其他诸如采血的位置,人的生理周期,饮食周期及时间周期(24h)等都会影响样品中的外泌体。所以取样的时候尽量定点定时。最后还需注意,尽量在采血30min内处理样本,因血液收集在收集管中时,血细胞和血小板还会分泌外泌体。

 

4、鼻涕

研究鼻涕有一个特殊的价值,其可以探索治疗性外泌体。啥是治疗性外泌体?在脑部的疾病治疗中,药物可以外泌体的方式注射到鼻腔,这样药物就可以避开血脑屏障。鼻涕的收集与许多环境因素相关,如年龄、季节、性别 、城市、过敏史及职业风险。鼻涕的收集方法没有统一标准,只需保证所有样本取样方法一致即可。

 

5、尿液
在尿液的取样中,除性别、年龄、进食等影响外,还有一个特殊的点即是尿液的新鲜程度,这个新鲜度指的是尿液在膀胱中存在的时间。

 

6、乳汁

乳汁中存在的外泌体、抗体等会影响新生儿的发育,具有较大的研究价值。泌乳的阶段、 胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂养、母亲的健康状态、精神状态等都会影响外泌体的分泌。需要注意的是乳汁中含有大量的脂蛋白,会对后面分离外泌体产生影响。

 

7、脑脊液

脑脊液研究面临的困难主要在样本的获取及样本中外泌体丰度少,有木有一种雪上加霜的感觉。那这个问题如何解决?国外可购买商业正常样本或者使用其他疾病样本作为对照。

 

二、外泌体的保存

对于外泌体的保存,和其他分子样品一样,提取的外泌体低温保存即可,短时间(一周之内)可放4度,长时间放-20或-80。也有人认为放4度更好,怕低温冻融会影响外泌体的完整性,但目前还没有一个定论,而且大部分文献认为没有影响。那到底放几度呢?有种技巧可以分装放-20或-80。

 

lamin b1tel

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