在前面的《传说中的RNA pull-down是啥?》一文中小编和大家一起学习了一种很有前景的研究RNA结合蛋白与其靶RNA之间互作的叫做RNA pull-down的技术,后来经过系统的学习,我们发现研究RNA与蛋白互作还有一种比较常见的技术叫做RIP 技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀),堪称RNA pull-down的姐妹。不过她研究的对象是RNA,不像RNA pull-down是以RNA作为探针研究RNA结合蛋白。
可能有同学要问了,在生物体中发挥作用的生物大分子主要是DNA和蛋白质,那研究RNA有啥意义呢?其实,95%的人类基因组并不编码基因,而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2%。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用,与白血病、糖尿病、艾滋病等多种病变密切相关,并且参与表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控,包括剪接(splicing)、出核转运(nuclear export)、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程,因此,对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此,RNA研究也被越来越多的科学家重视起来,目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域,而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法,帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。
RIP技术(来源360图片)
技术原理
RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行q-PCR验证或者测序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同,如:复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip,帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。
咋样,听起来很牛吧?她大致可以分为以下4个步骤:
1.用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
2.防止非特异性的RNA的结合。
3.免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
4.结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
但真实实验远没有这么简单,我们以某公司的RIP实验服务为例,再详细说下操作步骤。仅供参考,不同实验室因为仪器设备和试剂不同,会有细微差异。
RIP实验详细操作步骤
一、细胞裂解液获取
1.单层细胞或者贴壁细胞处理
(1)冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
(2)加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff管
(3)1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
(4)用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min
(5)每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃
2.悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解
3.组织样品处理
(1)冷PBS清洗新鲜切下的组织三次
(2)加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数
(3)1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
(4)用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min
(5)每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃
二、磁珠的准备
1.实验前准备试剂耗材
(1) enpendoff管、磁力架、冰盒、涡旋震荡器
(2)移液器、吸头放于超净台照射30min,移液器喷DEPC水
(3)RIP Wash Buffer和抗体置于冰上
- 磁珠准备过程
(1)重悬磁珠
(2)标记实验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照
(3)吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管
(4)每管加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡
(5)将enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次
(6)用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠
(7)室温孵育30min
(8)将enpendoff管置于磁力架上,弃上清
(9)加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次
(10)加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上
三、RNA结合蛋白免疫沉淀
- 准备工作
(1)冰盒、360°旋转仪
(2)RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
- RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程
(1)准备RIP Immunoprecipitation Buffer
(2)将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
(3)迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,14,000rpm,4℃离心10min。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml
(4)4℃孵育3h至过夜
(5)短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清
(6)加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6次
四、RNA纯化
1.实验前准备
(1)移液器、吸头、enpendoff管紫外照射30min,喷DEPC水以除RNA酶
(2)DEPC水、Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
(3)RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇
(4)离心机预冷
(5) 冰盒
2.RNA纯化过程
(1)准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
(2)用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
(3)55℃孵育30min
(4)孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中
(5)于每管上清液中加入250μlRIP Wash Buffer
(6)于每管加入400μl苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
(7)小心的吸取350μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管
(8)于每管加入400μl氯仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
(9)小心的吸取300μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管
(10)每管加入50μl Salt SolutionⅠ,15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ,850μl 无水乙醇(无RNase),混合,-80℃保持1h至过夜
(11)14,000rpm,4℃离心30min,小心去上清
(12)用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,小心去上清,空气中晾干.
(13)10-20μl DEPC水溶解,-80℃保存,测序
RIP实验应用举例
我们再来看1个应用RIP技术的具体案例:
使用目的蛋白寻找验证RNA(蛋白/RNA互作):
AP-1蛋白与RNA的相互作用RIP
好啦,这是我们目前找到的关于RIP技术的资料,以后再和大家一起学习刚才提到的染色质免疫沉淀ChIP技术相关的其他技术。