在前面的文章中我们和大家一起学习了RNA pull-down这种实验技术，好学且好奇心强的小编又很快发现一种和它挺像的叫做DNA pull-down的新技术，再一起来看看吧。
一、原理概述
DNA pull-down是体外研究DNA与蛋白互作的有力工具。该技术将生物素标记的DNA片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与细胞核蛋白孵育，纯化出与DNA片段互作的蛋白，洗涤洗脱得到的蛋白产物，做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合；做质谱鉴定即可筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。
生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用；其中活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联。因此用生物素标记核酸后，可以纯化出与该核酸结合的各种生物大分子复合物。
二、实验流程
DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针，探针经过脱硫生物素标记，跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合；纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体，经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除；最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，再经过Western Blot或质谱（MS）鉴定蛋白质类型。
以下为参考实验流程，不同实验室会有细微差异：
1．探针设计及标记
（1） 采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；
（2）将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功；
（3）使用PCR法或末端标记法标记探针；
（4）标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；
（5） -20℃保存，待用；
2．Pull down
（1） 预先混合 5µg 生物素标记的 DNA 和 500µg 核蛋白，置于冰上；
（2） 取 100µl Streptavidin-agarose G 磁珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000g 离心 30 秒；
（3） 将 DNA 与蛋白的混合物加到磁珠中，重悬磁珠；
（4） 4℃孵育 1 小时；
（5） 5000g，离心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
（6） 用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 离心 1 分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
（7） 加入 30µl 蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮 10 分钟，
3．蛋白质检测-- western blot
（1） 电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60ug总蛋白，开始电压为100v,到达分离胶后调为120v；
（2） 转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120min。
（3） 封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。
（4） 孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
（5） 孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min。
（6） 显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。
4．蛋白质检测-- MS
（1） 切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml EP管中。
（2） 清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。
（3） 脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。
（4） 脱水：加ACN 100ul脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
（5） 清洗：用200ul MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200ul 50% ACN震荡清洗2次，每次10分钟。
（6） 脱水：加ACN 100ul 脱水至胶粒变白，吸弃ACN。
（7） 用25mM NH4HCO3稀释Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min ，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃过夜(16h)。
（8） 质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；
（9） 离子源加速电压1为24kv；
（10） 加速电压2为22kv；
（11） 离子延迟提取0.000ns；
（12） 真空度1.4×10-7 Torr；
（13） 质谱信号单次扫描累加200次；
（14） 使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；
（15） 样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；
（16） 利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。
DNA-pull dwon模式图如下所示：
三、结果示意图：
额，好像跟RNA pull-down确实很像，就是RNA换成了DNA，检测的对象就变成了DNA与蛋白的互做。那么它有哪些应用呢？
四．技术应用
核酸与蛋白质的互作是细胞功能的核心，包括蛋白质合成、mRNA组装等生命活动中重要的代谢过程，研究核酸与蛋白质的互作是研究生命科学的基本工具。DNA pull-down主要用于目的DNA片段的互作蛋白（如转录因子等）筛选。
