在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活,影响最终的结果。为了避免这些情况的出现,可以在样品制备时尽可能低温下进行。此外,许多蛋白酶在pH9以上就失活了,因此Tris-base,碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性,此时,我们可以通过加入各种蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
根据催化中心结构的不同蛋白酶可分为以下4类:
1、丝氨酸蛋白酶
在其活性中心含有丝氨酸和组氨酸,如糜蛋白酶、弹性蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、胰酶等。
2、半胱氨酸蛋白酶(又称硫醇或SH蛋白酶)
在其催化中心含有半胱氨酸,如钙蛋白酶、组织蛋白酶B/C/L、木瓜蛋白酶等。
3、天(门)冬氨酸蛋白酶(羧基蛋白酶)
在其活性中心含有天(门)冬氨酸,如组织蛋白酶D、木瓜蛋白酶、肾素等。
4、金属蛋白酶
在其催化中心含有金属离子,如氨基肽酶、羧基蛋白酶A/B、嗜热菌蛋白酶等。
除了蛋白酶抑制剂以外,在许多研究过程中,尤其是一些制药公司和研究院所在研究药理学机理的时候,需要了解蛋白磷酸化途径,因此一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态,所以蛋白抽提的另一个重要保护过程就是对磷酸化状态的有效保护。
常见的蛋白酶抑制剂及其使用浓度如下:
抑制剂 | 靶蛋白 | 有效浓度 | 储藏溶液 | 注解 |
Antipain | 木瓜酶和胰酶 | 50μg/ml | 1mg/ml水溶液 | 对胰凝蛋白酶,胃液素,纤溶酶无影响 |
APMSF | 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶 | 10-40μg/ml或10-20μM | 100mmol/L水溶液 | 毒性比PMSF低,不能抑制胰凝蛋白酶或乙酰胆碱酯酶 |
抑肽酶 | 丝氨酸蛋白酶 | 0.06-2μg/ml | 10mg/mlPBS溶液 | 避免反复动冻融 |
抑氨肽酶B | 氨基肽酶 | 40μg/ml | 溶于甲醇 | 不能抑制羧肽酶 |
Calpain抑制剂Ⅰ、Ⅱ | Calpain (钙依赖性半胱氨酸蛋白酶) | Ⅰ:17μg/ml
Ⅱ:7μg/ml |
溶于乙醇 | 可渗透薄膜 |
抑糜朊酶素 | 胰凝乳蛋白酶 | 6-60μg/ml | 溶于DMSO | |
B.M.综合酶片 | 丝氨酸,半胱氨酸和金属蛋白酶 | 每10-50ml细胞提取液内加一片 | 不含EDTA | |
EDTA | 金属蛋白酶 | 0.2-0.5mg/ml或0.5-1.3μmol/L | 500mmol/L水溶液pH=8.0 | |
抑蛋白酶醛肽 | 丝氨酸蛋白酶,巯基蛋白酶 | 0.5-2μg/ml | 10mg/ml水溶液 | |
a2-巨球蛋白 | 广谱 | 1∪/ml | 100∪/ml PBS 溶液 | 避免接触还原剂 |
Pefabloc SC (boe- hringer Mannheim) | 丝氨酸蛋白酶 | 0.1-1.0mg/ml或0.4-4mmol/L | 100mM水溶液 | 无毒,在中性pH下较PMSF 稳定 |
胃蛋白酶抑制剂 | 酸性蛋白酶 | 0.7μg/ml | 1mg/ml甲醇溶液 | |
PMSF | 丝氨酸蛋白酶 | 17-170μg/ml | 10mg/ml异丙醇溶液 | 每一操作步骤时新鲜加入 |
TLCK | 胰蛋白酶 | 37-50μg/ml | 1mg/ml溶于50mMmol/L醋酸盐溶液,pH=5.0 | 对胰凝蛋白酶无影响 |
TPCK | 胰凝乳蛋白酶 | 70-100μg/ml | 3mg/ml乙醇溶液 | 对胰蛋白酶无影响 |
亮肽素 | 丝氨酸,半胱氨酸蛋白酶 | 0.5 ug/ml 或 1 mM | 1mg/ml水溶液 | |
AEBSF | 丝氨酸蛋白酶 | 4 mM | 抑制活性与PMSF相近,更易溶于水,毒性低 | |
氟化钠 | 酸性磷酸酶 | 10-20mM | 5M水溶液 | |
正钒酸钠 | 酪氨酸磷酸酶,碱性磷酸酶 | 1mM | 100mM水溶液 | 原钒酸钠需要处理后才能成为激活的正钒酸钠 |
焦磷酸钠 | 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 | 1-2mM | 100mM水溶液 | |
β-磷酸甘油 | 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 | 25mM | 100mM水溶液 |