常见的蛋白酶抑制剂

在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活,影响最终的结果。为了避免这些情况的出现,可以在样品制备时尽可能低温下进行。此外,许多蛋白酶在pH9以上就失活了,因此Tris-base,碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性,此时,我们可以通过加入各种蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

 

蛋白酶抑制剂

 

根据催化中心结构的不同蛋白酶可分为以下4类:

 

1、丝氨酸蛋白酶

在其活性中心含有丝氨酸和组氨酸,如糜蛋白酶、弹性蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、胰酶等。

 

2、半胱氨酸蛋白酶(又称硫醇或SH蛋白酶)

在其催化中心含有半胱氨酸,如钙蛋白酶、组织蛋白酶B/C/L、木瓜蛋白酶等。

 

3、天(门)冬氨酸蛋白酶(羧基蛋白酶)

在其活性中心含有天(门)冬氨酸,如组织蛋白酶D、木瓜蛋白酶、肾素等。

 

4、金属蛋白酶

在其催化中心含有金属离子,如氨基肽酶、羧基蛋白酶A/B、嗜热菌蛋白酶等。

 

除了蛋白酶抑制剂以外,在许多研究过程中,尤其是一些制药公司和研究院所在研究药理学机理的时候,需要了解蛋白磷酸化途径,因此一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态,所以蛋白抽提的另一个重要保护过程就是对磷酸化状态的有效保护。

 

常见的蛋白酶抑制剂及其使用浓度如下:

 

抑制剂 靶蛋白 有效浓度 储藏溶液 注解
Antipain 木瓜酶和胰酶 50μg/ml 1mg/ml水溶液 对胰凝蛋白酶,胃液素,纤溶酶无影响
APMSF 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶 10-40μg/ml或10-20μM 100mmol/L水溶液 毒性比PMSF低,不能抑制胰凝蛋白酶或乙酰胆碱酯酶
抑肽酶 丝氨酸蛋白酶 0.06-2μg/ml 10mg/mlPBS溶液 避免反复动冻融
抑氨肽酶B 氨基肽酶 40μg/ml 溶于甲醇 不能抑制羧肽酶
Calpain抑制剂Ⅰ、Ⅱ Calpain (钙依赖性半胱氨酸蛋白酶) Ⅰ:17μg/ml

Ⅱ:7μg/ml

溶于乙醇 可渗透薄膜
抑糜朊酶素 胰凝乳蛋白酶 6-60μg/ml 溶于DMSO
B.M.综合酶片 丝氨酸,半胱氨酸和金属蛋白酶 每10-50ml细胞提取液内加一片 不含EDTA
EDTA 金属蛋白酶 0.2-0.5mg/ml或0.5-1.3μmol/L 500mmol/L水溶液pH=8.0
抑蛋白酶醛肽 丝氨酸蛋白酶,巯基蛋白酶 0.5-2μg/ml 10mg/ml水溶液
a2-巨球蛋白 广谱 1∪/ml 100∪/ml PBS 溶液 避免接触还原剂
Pefabloc SC (boe- hringer Mannheim) 丝氨酸蛋白酶 0.1-1.0mg/ml或0.4-4mmol/L 100mM水溶液 无毒,在中性pH下较PMSF 稳定
胃蛋白酶抑制剂 酸性蛋白酶 0.7μg/ml 1mg/ml甲醇溶液
PMSF 丝氨酸蛋白酶 17-170μg/ml 10mg/ml异丙醇溶液 每一操作步骤时新鲜加入
TLCK 胰蛋白酶 37-50μg/ml 1mg/ml溶于50mMmol/L醋酸盐溶液,pH=5.0 对胰凝蛋白酶无影响
TPCK 胰凝乳蛋白酶 70-100μg/ml 3mg/ml乙醇溶液 对胰蛋白酶无影响
亮肽素 丝氨酸,半胱氨酸蛋白酶 0.5 ug/ml 或 1 mM 1mg/ml水溶液
AEBSF 丝氨酸蛋白酶 4 mM 抑制活性与PMSF相近,更易溶于水,毒性低
氟化钠 酸性磷酸酶 10-20mM 5M水溶液
正钒酸钠 酪氨酸磷酸酶,碱性磷酸酶 1mM 100mM水溶液 原钒酸钠需要处理后才能成为激活的正钒酸钠
焦磷酸钠 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 1-2mM 100mM水溶液
β-磷酸甘油 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 25mM 100mM水溶液

 

jieweitu

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