什么情况下你会认为你的蛋白可能是磷酸化了?也许是跑出来的条带很模糊,略高于预测,或者你认为它参与了信号级联。不管什么情况,如果你怀疑目标蛋白磷酸化,那么就该检查是否真的磷酸化了。
什么情况下你会认为你的蛋白可能是磷酸化了?也许是跑出来的条带很模糊,略高于预测,或者你认为它参与了信号级联。不管什么情况,如果你怀疑目标蛋白磷酸化,那么就该检查是否真的磷酸化了。
你可以采取的第一步是:通过检查蛋白序列来预测蛋白的磷酸化。
蛋白磷酸化都需要有特定的信号
如果你的蛋白有磷酸化的趋势,那么它需要包含磷酸化共有序列。
一些激酶,例如表皮生长因子受体,具有已经定位的特异性的共有序列。可以通过检查蛋白序列,看看它是否有特定的激酶识别位点。然而,另一些激酶不需要这样的特异性共有序列或共有序列还没有被定位。对于那些,可以应用其它规则。在真核生物中,蛋白质磷酸化通常发生在丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸和组氨酸(在低等真核生物中)残基上。
激酶识别和随后蛋白的磷酸化取决于残基存在的位点。位点周围的氨基酸构成共有位点。在真核生物中,当残基位于一个或多个碱性氨基酸附近时,常常发生丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化。相反的,酪氨酸磷酸化发生在残基紧邻酸性氨基酸时。这些一般规则是复杂的,因为一些激酶严重依赖于蛋白质的3d结构的识别。此外,许多蛋白质含有多个磷酸化位点,并且可能发生磷酸化级联反应,一个残基的磷酸化可能仅在另一个残基被磷酸化之后发生。
蛋白磷酸化预测软件
感谢生物信息学的发展,你可以使用在线程序预测蛋白中潜在磷酸化位点。
许多可用的程序包括,Vector NTI(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/vector-nti-software.html#)或 MacVector(http://macvector.com/),内置的蛋白质分析软件,可以预测潜在的磷酸化位点。
或者,有大量免费软件或免费在线服务来预测蛋白磷酸化,包括:
Cuckoo Workgroup 团队:GPS(http://gps.biocuckoo.org/index.php)
生物序列分析中心:NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)
Cell Signaling Technology:PhosphositePlus(http://www.phosphosite.org/staticUsingPhosphosite.action)
当你使用这些分析软件时,切记它们只是一个预测工具,事实还需要靠实验来证明!如何保证磷酸化蛋白实验的顺利,请点击[技能 get √]磷酸化蛋白Western Blot的注意事项