对于大多数蛋白而言,标准的SDS-PAGE在下游应用,如western-blot之前能很好地分离蛋白分子。但是如果目的蛋白为小分子量蛋白,如小于10kDa呢?看以下解决方案
上次和大家一起分享了5步跑出漂亮的大分子蛋白western-blot,反响热烈,详见http://www.bio-review.com/western-blot-operating-steps/。今天和大家一起讨论下小分子蛋白分离解决方案。
对于大多数蛋白而言,标准的SDS-PAGE在下游应用,如western-blot之前能很好地分离蛋白分子。但是如果目的蛋白为小分子量蛋白,如小于10kDa呢?这些小分子量蛋白,不结合SDS(蛋白质分离中的关键组分),随着缓冲液迁移,并且不容易彼此分离。
当分离小分子量蛋白时,你需要重新考虑凝胶的种类。如下建议,也许能够派的上用场!
Tris-tricine凝胶
Tris-tricine凝胶系统由Shaggar 和Von Jagow发明,旨在分离小至1kDa的蛋白。Tris-tricine凝胶系统使用2种不同的缓冲液:阳极缓冲液和阴极缓冲液,其含三甲基甘氨酸,代替含有甘氨酸的单一电泳缓冲液。根据在凝胶中使用的丙烯酰胺的百分比,它们可以用于精细地分辨1-100kDa之间的蛋白。
Tris-tricine凝胶系统优势:
. 使用含10-16.5%丙烯酰胺的凝胶,完美分辨1-100kDa之间的蛋白;
. 不需要添加尿素(尿素可以干扰下游反应,但添加尿素可以获得更高的分辨率);
. 不必担心凝胶过载;
. 同样适用溶解在高离子强度溶液中的蛋白;
. 在免疫印迹期间,蛋白能有效地转移出凝胶。
详细的Tris-tricine凝胶制作、染色及转印过程见http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html#progrp3
梯度凝胶
顾名思义,梯度凝胶在整个凝胶中含有连续的线性梯度的丙烯酰胺。丙烯酰胺的浓度范围可以在3-30%之间,但是你可以调整浓度以优化蛋白的分辨率。当蛋白通过增加的丙烯酰胺浓度凝胶移动时,逐渐减小的孔径会阻止蛋白的移动。
梯度凝胶被认为能:
. 增强分辨率
. 得到清晰的蛋白质条带 ·
. 在单一凝胶上分离不同分子量的复杂蛋白混合物
制作梯度凝胶可能是棘手的,需要一个梯度凝胶装置浇注。然而,许多公司出售具有不同范围的预倾倒梯度凝胶。
记住:不要让蛋白的大小阻止你前进的脚步,总有一种方案会适合你!