槲皮素通过PLCγ-IP3R相关的Ca2+波动抑制Mrgprx2诱导的伪过敏反应

 

过敏反应是由肥大细胞活化,特别是组胺和脂质介质引起的潜在致命的超敏反应。由药物反应引起的组胺释放被认为是一种假性过敏反应。槲皮素以其抗过敏免疫作用而闻名。但目前对其抗伪变态反应作用及其机制的研究较少。因此,本研究旨在评价槲皮素在体内的抗伪过敏作用,并探讨其体外作用机制。用小鼠模型在体内评价槲皮素的抗伪变态反应活性,用表达Mrgprx2(肥大细胞特异性受体)和LAD2肥大细胞系的HEK293细胞在体外检测槲皮素的作用机制。体内实验结果表明,槲皮素能明显减轻C57BL/6小鼠爪蟾伊万斯蓝渗漏和后爪厚度,并能显著抑制血清组胺和趋化因子释放。此外,它还以剂量依赖性的方式抑制钙离子的动员,减弱了腹腔肥大细胞中组胺和MCP-1的释放。此外,它还抑制了组胺引起的血管扩张、嗜酸性粒细胞的释放和脱粒肥大细胞的百分比,表明槲皮素在体内对抗肥大细胞介质,组胺诱导的血管扩张和嗜酸性粒细胞的释放。

 

体外实验结果表明,槲皮素与地塞米松(100μM)(肥大细胞稳定剂)在LAD2肥大细胞系中具有相似的作用,可减少伪过敏性钙流入,抑制脱粒和趋化因子释放。此外,槲皮素抑制了Mrgprx2诱导的钙流入和表达Mrgprx2的HEK293细胞的伪过敏反应。组胺启动子C48/80和P物质(非整肽)EC50与槲皮素联合使用时,前者比后者高,说明槲皮素可抑制Mrgprx2诱导的伪过敏反应。此外,槲皮素降低了由c48/80诱导的LAD2肥大细胞株的PLCγ-ip3r信号通路激活。与非特应性对照(NC)转染的LAD2人肥大细胞相比,槲皮素(200μM)降低了c48/80诱导的钙通量,降低了β-己糖胺酶、组胺、MCP-1和IL-8的释放,提示槲皮素对LAD2人肥大细胞具有抗伪变态反应的作用。与Mrgprx2相关。对接结果表明,槲皮素与Mrgprx2具有良好的结合亲和力,类似于P物质和C48/80物质。因此,槲皮素通过与PLCγ-IP3R相关的Ca2+波动抑制Mrgprx2诱导的伪过敏反应。

 

我们的研究结果证实槲皮素是一种有效的小分子,通过PLCγ-IP3R相关的Ca2+波动抑制Mrgprx2诱导的伪过敏反应,从而突出了抑制Mrgprx2诱导的伪过敏相关疾病的潜在候选物。

 

  • 背景

 

在高亲和力的IgE受体(fcεRI)独立通路中,肥大细胞可被多种刺激物激活,包括基本促分泌药(如C48/80和P物质)、THIQ原药(如阿曲库铵)、肽能药(如阿托邦)和氟喹诺酮类(如环丙沙星)。最近的研究表明,它们都是Mrgprx2的配体,Mrgprx2是一种与人MAS相关的G蛋白偶联受体x2的同源物。人皮肤在朗格汉斯细胞表面有丰富的P物质结合位点,激活后抑制抗原提呈过程。P物质与各种皮肤和全身瘙痒有关,如特应性皮炎和胆汁淤积。对于慢性荨麻疹(CU)患者,皮内注射神经肽(如P物质和血管活性肠肽)的肺反应明显大于非过敏性对照(NC)受试者,且持续时间更长。Mrgprx2通过激活磷脂酶C(plc)信号通路诱导Ca2+活化和肥大细胞脱粒

 

到目前为止,还没有治疗过敏性疾病的方法。一些药物如抗组胺药、免疫抑制剂和肥大细胞稳定剂只能帮助缓解过敏症状和减轻过敏反应的疼痛,而且这些药物还有一些副作用。

 

槲皮素是一种生物黄铜化合物。茶、苹果、洋葱、苹果和葡萄等饮食中含有生物类黄酮,槲皮素是我们饮食中的主要成分。槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射和抗病毒作用,并具有抗心血管疾病的活性。此外,还能改善毛细血管微循环和脑血液循环,抑制血小板聚集。由于这些特性,它已被用于治疗多种疾病,包括脑梗死、冠心病和脑血栓形成。然而,没有关于槲皮素对伪过敏反应的影响的研究。

 

  • 结果

 

  1. 槲皮素对人肥大细胞的毒性研究

 

采用CCK-8法测定槲皮素对LAD2细胞活力的影响。槲皮素即使在400μm的最高浓度下也不会显著影响细胞的活力(图1a)。因此,在随后的实验中,使用低于400μm的槲皮素浓度。此外,槲皮素对钙通量(图1b)、组胺(图1c)和β-己糖苷酶释放(图1d)没有任何影响。因此,槲皮素对LAD2细胞没有任何激活作用。

 

槲皮素对人肥大细胞的影响

图1所示。槲皮素对人肥大细胞的影响。

 

  1. 槲皮素能减弱伪过敏介导的LAD2细胞钙通量

 

钙离子注入对组胺释放和肥大细胞脱粒有显著影响。c48/80可以调动肥大细胞中的钙储存。P物质能激活肥大细胞,引起细胞内Ca2+活化和细胞脱粒,释放组胺。在我们的研究中,槲皮素以剂量依赖的方式(0、50、100和200μm)降低了c48/80(图2a1-e1)或P物质(图2a2-e2)诱导的Lad2人肥大细胞的钙通量。此外,槲皮素(100μm)降低c48/80并诱导钙通量的作用与地塞米松(100μm)(肥大细胞稳定剂)在相同肥大细胞中的作用相似(图13a、b)。因此,槲皮素可以降低伪过敏性诱发的Ca2+波动。

 

槲皮素减弱了LAD2细胞中伪过敏触发的钙通量

图2 槲皮素减弱了LAD2细胞中伪过敏触发的钙通量。

 

  1. 槲皮素对LAD2细胞伪变态反应介导的去颗粒和趋化因子的影响

 

肥大细胞的激活可导致如β-己糖胺酶、组胺和合成细胞因子(包括MCP-1和IL-8)等预先形成的炎症介质的快速分泌,这是过敏性炎症所必需的。为了验证槲皮素是否能通过促进脱粒作用抑制c48/80或P物质诱导的肥大细胞的活化,用lad2细胞检测β-己糖胺酶和组胺、MCP-1和IL-8的变化。槲皮素可分别通过c48/80或P物质处理抑制β-己糖胺酶(图3a1、a2)和组胺(图3b1、b2)的分泌。

 

与单独使用C48/80或P物质相比,槲皮素分别抑制MCP-1(图3c1、c2)和IL-8(图3d1、d2)的分泌。此外,槲皮素(100μm)降低β-己糖胺酶、组胺、MCP-1和IL-8释放的作用与地塞米松(100μm)(肥大细胞稳定剂)在相同肥大细胞中的作用相似(图12c,d)。因此,槲皮素对用C48/80或P物质处理的LAD2细胞中β-己糖胺酶、组胺、MCP-1和IL-8的释放有抑制作用,表明槲皮素能抑制伪变态反应诱导的肥大细胞脱粒和趋化因子的释放。

 

Chemokines

图3 槲皮素降低了LAD2细胞中假过敏性触发脱粒和趋化因子的释放。

 

结论

 

CU是一种系统性每日乳清,持续至少6周。肥大细胞通过释放各种血管活性类固醇和功能多样的蛋白酶、趋化因子和细胞因子,在诱导风疹反应中发挥重要作用。众所周知,30%到50%的CU患者有自身免疫基础,因为这些患者表现出对高亲和力的IgE受体fcεRI或异常的IgE的自身抗体。剩下的约50%的CU患者患有真正的“特发性”疾病。近年来,Mrgprx2被发现是人脐带血源性肥大细胞(包括P物质、C48/80、VIP、皮质抑素和生长抑素)中碱性肽的受体。一项研究表明,重度CU患者皮肤肥大细胞中Mrgprx2的表达明显高于NC患者。人皮肤肥大细胞能够表达功能性Mrgprx2,不仅对P物质有反应,而且对主要的碱性蛋白和嗜酸性粒细胞过氧化物酶也有反应。因此,用Mrgprx2阻断人皮肤肥大细胞可能为严重铜中毒的预防和治疗提供一种新的方法。Mrgprx2可能是治疗重症铜患者风疹的新靶点。然而,荨麻疹的有效治疗还需要进一步研究,因此,开展相关的基础研究至关重要。在本研究中,我们的研究结果表明,槲皮素的抗伪变态反应作用是由Mrgprx2介导的,为后续研究寻找抗铜药物提供了依据。

 

在我们的体外研究中,LAD2细胞被用来评价槲皮素的抗伪过敏作用。此外,还用c48/80和P物质作为阳性肥大细胞活化剂。槲皮素剂量依赖性地抑制了LAD2细胞的钙离子活化,并以与地塞米松(100μm)(肥大细胞稳定剂)相似的方式抑制了β-己糖胺酶、组胺、MCP-1和IL-8的释放,表明槲皮素可以抑制肥大细胞的生长。降解和趋化因子释放。槲皮素抑制C57BL/6小鼠C48/80或P物质所致的伪假变态反应,小鼠组胺、MCP-1和IL-8血清含量表明槲皮素能显著抑制拟变态反应诱发的脱颗粒。槲皮素对小鼠后爪肿胀和埃文斯蓝渗出具有剂量依赖性。槲皮素剂量依赖性地抑制了腹膜肥大细胞的钙离子活化,并减弱了组胺和MCP-1的释放,提示其具有抗伪过敏作用。此外,它还抑制了组胺引起的血管扩张,降低了嗜酸性粒细胞的释放和脱粒肥大细胞的百分比,表明槲皮素对体内脱粒肥大细胞有拮抗作用,组胺诱导了血管扩张和嗜酸性粒细胞的释放。

 

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