| Abbikine产品：Goat anti-mouse (1:5000, A21010, Abbkine, USA) Rabbit anti-goat (1:5000, A21110, Abbkine, USA) 英文名：Identification of serum metabolites associating with chronic kidney disease progression and anti-fibrotic effect of 5-methoxytryptophan 中文名：鉴定慢性肾病进展相关的血清代谢物和5-甲氧基色氨酸的抗纤维化作用 杂志：nature communications 影响因子：12.353 作者单位：Northwest University 院系：Faculty of Life Science & Medicine 研究方向：医药与生命科学 |
研究背景：
慢性肾病（CKD）导致肾功能逐渐丧失，导致终末期肾病，需要透析或肾移植。虽然CKD的早期阶段1-2阶段几乎没有迹象或症状，并且直到晚期才发现疾病，心血管疾病发病率和死亡率的风险随着CKD的进展而增加。
CKD的常规临床评估基于测量肾损伤（蛋白尿）的标志物并估计肾功能（估计的肾小球滤过率，eGFR）。然而，使用血清肌酸酐估计eGFR可能受到非肾过程（例如，肌肉量或高龄）的影响，并且因此与实质性误差相关。同时，蛋白尿（白蛋白尿）的评估也可能受到非肾过程（例如发烧，感染）的影响。此外，在许多原发性肾病中成功解决肾损伤后，蛋白尿可能持续很长时间，导致许多患者的治疗不必要地升级。由于基于eGFR错误标记CKD5状态的可能性以及基于蛋白尿的肾损伤评估非常高，因此迫切需要更好地评估肾功能以提高CKD诊断的准确性。
在大规模流行病学研究中使用人类血浆的高通量和高分辨率代谢组学分析已经在充分表征的人群中实现了代谢表型分析。代谢组学有可能通过阐明潜在的代谢途径并发现潜在的生物标志物来提供对疾病机制的深入了解。我们相信代谢组学具有通过提供阶段特异性和损伤检测生物标记来改善CKD诊断和管理的潜力。
最近的一些综述报道了代谢组学在鉴定肾脏疾病生物标志物中的应用。对于这类生物标志物而言，这似乎是相对于多变量蛋白质组学标志物的一个令人兴奋的机会，其将早期CKD的高风险进展分类。早期CKD患者的eGFR和白蛋白尿的临床风险评估效率低，阻碍了替代疗法的开发，甚至针对有早期干预风险的患者，以防止肾脏损害的发展。我们预计，我们鉴定的代谢物将改善现有的临床标志物，并满足药物开发和临床实践领域中两个大的和相关的未满足的需求。
在这项研究中，我们招募了2155名受试者，使用超高效液相色谱结合四极杆飞行时间SYNAPT高清质谱（UPLC-HDMS）鉴定潜在的早期CKD代谢物生物标志物，该物质已被证明具有出色的选择性和灵敏度和再现性。在细胞和动物模型中检查最有希望的代谢物5-甲氧基色氨酸（5-MTP）的抗炎和抗纤维化作用以及其调节酶色氨酸羟化酶-1（TPH-1）的生物学作用。本研究表明，5种代谢产物可以将患有早期CKD的患者与健康对照分开，并作为CKD早期的准确生物标志物。从机制上看，5-MTP及其调节酶TPH-1的缺失有助于肾损伤。激活NF-κB并抑制核因子红细胞-2相关因子2（Nrf2）通路。因此，TPH-1可以作为CKD治疗的靶标。
研究目的
早期发现和准确监测慢性肾脏疾病（CKD）可以改善护理并延缓进展至终末期肾病。在这里，我们使用2155名参与者（包括1-5期CKD患者和健康对照组）的非靶向代谢组学鉴定了5种代谢物，包括5-甲氧基色氨酸（5-MTP），其水平与肾脏疾病的临床标志物密切相关。 5-MTP水平随着CKD的进展而降低，并且在单侧输尿管梗阻（UUO）后的小鼠肾脏中降低。用5-MTP治疗改善肾间质纤维化，抑制IκB/ NF-κB信号传导，并增强具有UUO或缺血/再灌注损伤的小鼠以及培养的人肾细胞中的Keap1 / Nrf2信号传导。色氨酸羟化酶-1（TPH-1）（一种参与5-MTP合成的酶）的过度表达通过减轻肾脏炎症和纤维化来减轻肾损伤，而TPH-1缺乏通过激活NF-κB和抑制Nrf2途径加剧肾损伤和纤维化。 总之，我们的结果表明TPH-1可以作为CKD治疗的靶标。
研究对象与方法
- 研究对象：2155个不同肾病阶段的病人，图1中的血液和样本来自陕西中医医院，西安第四医院和宝鸡市中心医院（2-2016.11期间）的病人。
- 非靶向代谢组学和代谢物的测定：UPLC分析，质谱分析（MS）。
- UPLC-HDMS方法评估
- 靶向代谢组学和血清生物标志物的测定。
- 生物标志物发现的模型构建。
- 动物模型和治疗方案：BALB/c小鼠用UUO处理建模。
- TPH-1体内基因下调和基因敲入。
- 细胞培养和药物处理
- 免疫组化，免疫荧光及其共聚焦拍照和WB分析
结果
研究人群的人口统计学特征。健康对照和1-5级CKD患者的一般临床和人口统计学数据见补充表1.年龄，体重（ BW），体重指数（BMI），血压，eGFR，血清肌酐（CREA）和尿素浓度，蛋白尿和尿蛋白/肌酐比值与CKD分期显着相关。
独立验证数据集包含30名健康对照，30名CKD1患者和30名CKD2患者。 每组的CREA水平分别为64.4±14.8,66.8±17.6和77.2±20.5μmol/ l。类似地，健康对照的CKD1和CKD2的尿素水平分别为5.3±1.4,5.2±1.5和6.1±2.4mmol / l。这些结果表明，三组间血清CREA和尿素无显着差异。
为了进一步减少用于临床应用和功能分析的代谢物的数量，我们对这98种代谢物和17项临床指标又进行了一轮特征还原。本模型选取5种代谢物。五代谢物包括5-MTP canavaninosuccinate (CSA) acetylcarnitine tiglylcarnitine和牛磺酸可以清楚地分辨CKD的所有临床阶段(图1 a e和补充表2)。序数回归套索模型还透露,克雷亚和尿素,可以清楚地分辨晚期CKD(图1 f, g),然而他们并不是有效的区分CKD1患者与健康对照组。蛋白尿也显示出CKD患者与健康对照组之间的巨大差异(图1h)。4种代谢物呈负相关(5- mtp p=8.22×10−13,CSA p=2.99×10−5，替格利肉碱p=7.17×10−9，牛磺酸p=1.63×10−7)，乙酰肉碱呈正相关(p=3.19×10−13)。五种代谢物的变化如图1a-e所示。
五种代谢产物的外部验证。对30名健康对照者、30名CKD1患者和30名CKD2患者进行了5种代谢物的外部验证。补充表3给出了该队列的一般临床和人口统计数据。补充表4显示了临床变量与eGFR之间的关系，所有方向的关系与最初的发现一致。由于我们的目标是早期CKD检测，所以没有选择ckd35进行外部验证。验证使用无监督聚类,主成分分析(PCA),监督随机森林和支持向量机显示近乎完美的分类主题在正常健康对照组,CKD1和CKD2(图2 f i)。外部验证结果提供进一步的证据表明,五个代谢物潜在生物标志物的额外与早期慢性肾病蛋白尿分离学科从正常健康对照组。
图1 选择5种代谢物进行不同CKD分期的鉴别。
5-mtp的肾保护作用。在这五种代谢物中，5-mtp是在进行性CKD中发现的代谢物之一，与eGFR密切相关，这与以前的发现一致。此外，5-MTP对血管损伤的保护作用也得到了证实，这与慢性肾病密切相关。5-MTP的抗炎作用已被几项研究证实，但在肾损伤或肾小管上皮细胞的动物中未被证实。因此，我们在体外和体内研究了5-MTP对肾脏的保护作用。为了确定5-MTP的组织特异性，我们测量了多个器官中5-MTP的水平。结果表明，在单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠中，5-mtp在肾脏中的下降比在心脏、肝脏、肺、脾、前列腺和大脑等其他器官中的下降更为显著（图2a）。
接下来，采用UUO小鼠来证明5-MTP的抗炎和抗纤维化作用。腹腔注射5-MTP，剂量分别为10和100 mg/kg/天，持续1周。苏木精、伊红（H&E）和Masson染色显示UUO小鼠的肾脏炎症和纤维化被5-mtp减弱（图2b）。这与增加nrf2、血红素加氧酶-1（ho-1）、NAD（p）H醌脱氢酶1（nqo-1）、抑制kappa bα（iκbα）和减少磷酸化iκbα（p-iκbα）、核因子kappa b p65（nf-κb p65）、单核细胞趋化蛋白-1（mcp-1）和环氧合酶-2有关。（COX-2）指出5-MTP可减轻UUO的炎症（图2c，d）。肾间质中的CD3+和CD68+细胞数量显著减少5-mtp（图2e，f）。同样，免疫组化检查显示5-mtp可使肾间质中纤维连接蛋白和波形蛋白的表达减弱（图2g）。纤维蛋白I型胶原、纤维连接蛋白、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在5-MTP治疗后下调（图2h，i）。
图2 5-MTP的体内抗炎、抗纤维化作用
接下来，我们评估了5-MTP对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的hk-2细胞和脂多糖（LPS）诱导的HMC炎症和纤维化的潜在抑制作用。用5-MTP治疗可显著抑制炎症标记物（IκBα、P-IκBα、NF-κB p65、MCP-1和COX-2）的表达，并恢复hk-2和hmc细胞中的细胞保护途径（nrf2、ho-1和nqo-1）的表达，高浓度5-MTP显示出更强的抗炎作用。影响（图3a-f）。Western blot分析和免疫荧光染色显示，5-mtp可抑制包括NF-κB p65、MCP-1和COX-2的表达以及细胞保护性抗炎转录因子nrf2及其靶基因产物ho-1和nqo-1的表达增加（图3a-f）。5-mtp也降低了IκBα的磷酸化。用5-MTP治疗也能显著抑制原纤维蛋白I、纤维连接蛋白、波形蛋白、α-SMA的上调（图3g，h）。免疫荧光染色显示5-mtp减弱了TGF-β1诱导的hk-2细胞中波形蛋白的表达（图3i）。此外，5-MTP通过增强上皮和系膜细胞标记物、E-钙粘蛋白和THY1的表达，减轻了上皮和系膜细胞损伤。综上所述，5-MTP在体外和体内具有较强的抗炎和抗纤维化作用。
图3 5-MTP的体外抗炎、抗纤维化作用
TPH-1对肾脏疾病的保护作用。我们假设TPH-1上调内源性5-MTP对肾脏疾病有良好的治疗作用。TPH-1是L色氨酸合成5-MTP的关键酶，TPH-1的敲除与5-MTP的下调有关。TGF-β1和LPS刺激肾损伤后，TPH-1表达降低（图4a）。TPH-1的敲除抑制了上皮细胞标记物的表达，并增加了促纤维化标记物的表达（图4b-d）。我们进一步研究了tph-1在uuuo和肾缺血/再灌注损伤（iri）小鼠中的表达，发现在uuuo和iri小鼠中tph-1的表达显著下调（图4e）。TPH-1的过度表达导致小鼠5-MTP的显著上调（图4f，g），而TPH-1的过度表达降低了UUO小鼠的促炎和促纤维化标记物的表达（图4h-k）。相反，TPH-1缺乏可加重UUO小鼠的炎症和纤维化（图4L-O）。综上所述，这些结果确定TPH-1是治疗慢性肾病的潜在治疗靶点。
图4 TPH-1在肾损伤中的保护作用
创新点
本研究发现了5种代谢产物，可将早期慢性肾病患者与健康对照组分离，并作为早期肾病的准确生物标志物。这些生物标志物可以作为对现有肾脏疾病生化指标的有用补充。我们的结果表明，这五种代谢物可以将早期慢性肾病患者与健康对照者分开。从机制上讲，5-mtp及其调节酶tph-1的缺失通过激活NF-κB和抑制nrf2途径导致肾损伤。因此，靶向TPH-1可能是治疗慢性肾病的一种策略。
Abbkine专注于免疫学和细胞学领域，致力于创新和研发各类抗体、蛋白质、分析试剂与试剂盒，以期成为生命科学研究发展、药物研发等领域的关键推动者。在这里，我们为您呈献蛋白和免疫研究用户最喜爱的产品，从免疫学基础产品，如蛋白提取定量，到免疫学实验的内参标签抗体、一抗及二抗等；细胞研究用户最喜爱的产品，从用于检测细胞状态的染料及试剂盒，细胞器提取试剂盒，细胞亚结构染色示踪及细胞代谢检测产品，到用于细胞培养的细胞因子及蛋白类检测试剂盒，只为助力您的研究事业！
About Abbkine Scientific Co., Ltd.
Abbkine Scientific Co., Ltd.成立于2012年。我们的使命，通过为全球科学家提供人类和动物健康研究所需的基础研究工具，以期成为研究探索的关键推动者。我们将通过明确的核心战略和促进诚信、开放、合作、创新和为客户服务的企业文化，为全球生命科学研究者提供买得起的高品质产品，实现我们的使命。
