将特异性抗原包被在固相载体上,加入含待测抗体的样品,使之与固相抗原结合(Ag-Ab),再加入酶标记的抗抗体(亦称二抗),与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。此时加入底物,复合物上的酶则催化底物而显色,以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。由于每步之间均有冲洗步骤,因此若样品中不含相应的抗体,酶标抗体则将被洗掉,底物不显色而呈阴性反应。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可以利用同一酶标抗抗体检测相应抗体的方法。
一、预实验
1、酶标抗体的最适浓度
- 用适当浓度的兔IgG(≈10ug/ml)进行包被,洗涤。
- 将酶标羊抗兔抗体用稀释液作一系列倍比稀释(1:100,1:200,…)后分别加入已包被的孔中,保温、洗涤。
- 加底物显色。加酸终止反应后,读取吸光度(A)。
- 结果判读:读取A值在0左右,且空白对照的A值<0.1时的酶标抗体稀释度,作为酶标抗体的工作浓度。
2、底物浓度的选择
用配制不同浓度的底物液:
- 取1ml底物缓冲液加128ul TMB,后对半稀释成6个梯度,128,64,32,…
- 取1ml底物缓冲液加128ul 30%H2O2,后对半稀释成6个梯度,128,64,…
- 各取50ul的A、B液于同一孔中,后加最适浓度的酶标抗体10ul,显色后观察吸光值。
- 结果判读:最大吸光值的孔,其TMB与H2O2的比即为最适底物浓度。
3、包被抗原浓度的选择
- 用包被液将抗原做一系列稀释后进行包被,洗涤。
- 将阳性样本,和阴性样本用稀释液作1:100稀释加样,保温,洗涤。
- 加按工作浓度稀释的酶标羊抗兔IgG抗体,保温,洗涤。
- 加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
- 结果判读:选择阳性样本的A值为≥1、阴性样本的A值<2的包被抗原的稀释度作为工作浓度。
二、正式实验
1、包被:
将抗原(BSA-Ag偶联物)用包被缓冲液稀释为10ug/ml(视抗原,可1-40ug/ml)左右(预实验中确定最适浓度),加入聚苯乙烯板(0.1ml/孔),加封口膜于4℃过夜(或37℃下,孵育6h)。可包被BSA溶液或只加包被液作为空白对照。
2、封闭:
弃去孔内液体,每孔加200ul封闭液(近满),37℃湿盒保持6h(或4℃过夜),避免非特异性吸附。
3、洗涤:
弃反应液,以洗涤缓冲液洗板3-5次并于吸水纸上轻轻拍干。
4、加待测样品:
以稀释液将待测样品做适当的梯度系列稀释,分别加入到包被有已知抗原的反应孔中,每个稀释度二孔(0.1ml/孔),并加空白(PBST)或阴性对照液,加封口膜后于37℃水浴箱中温育反应45min。不宜太长,否则会提高本底。
5、洗涤:
重复步骤3)。
6、加酶标二抗:
以稀释液将酶标抗体做1:1000以上适当稀释(预实验中确定最适浓度),加入反应孔中(0.1ml/孔),加封口膜后于37℃水浴箱中温育反应45min。
7、洗涤:
重复步骤3)。
8、显色:
加底物液(预实验中确定最适浓度),每孔加0.1ml,室温下避光反应10-30分钟,其间不时观察,显色满意即加终止液。
9、终止:
加终止液50ul/孔终止反应。
10、测OD值:
用酶标仪测定每孔在450nm波长的OD值。
11、结果判读:
若待测孔OD>0.1,且大于阴性对照孔的2.1倍(P/N>2.1,其中P待测血清在某一稀释倍数测定的OD值,N为阴性血清在相应稀释倍数时测定的OD值),判定为阳性,以判定为阳性的血清最高稀释倍数为血清抗体效价。(或把OD450值绘图后,观察曲线的变化趋势,应是一条S形的曲线,中点值为其效价。)