单克隆抗体的生产

单克隆抗体广泛应用于实验室研究、诊断产品和免疫治疗,比多克隆抗体具有多重优势。它们对单一抗原表位有很强的特异性,很少或没有可变性,并且易于根据需要进行修改和定制。

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单克隆抗体的历史

 

1984年,乔治·科勒、塞萨尔·米尔斯坦和尼尔斯·杰恩获得了诺贝尔生理学和医学奖,由于他们在单克隆抗体方面的杰出研究成果。他们的研究奠定了利用杂交瘤技术进行大规模商业单克隆抗体生产的基础。这项技术涉及用抗原注射实验室小鼠或大鼠,而这种抗原是针对所需要的单克隆抗体。产生所需抗体的B细胞是从免疫动物的脾细胞中分离出来的,这些B细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞株。经过仔细的选择和筛选过程,杂交细胞大规模地生长。选择的杂交细胞被注射到小鼠腹腔内,诱导产生一种叫做腹水的抗体浓缩液体。

 

体外单克隆抗体的生产

 

依赖动物产生抗体的技术越来越受到道德关注,这导致了抗体生产的体外技术的发展,在仔细监管的条件下,杂交细胞在培养基中生长。各种哺乳动物细胞株和细菌菌株也通过基因工程来表达抗体。然而,体外单克隆抗体的生产也存在许多挑战。

 

产量低:在体外培养的培养基中,其抗体/ ml的含量往往低于体内腹水的方法。

细胞死亡:维持最佳的细胞生长和生存能力对于高抗体产量和优化过程至关重要。

污染:体外生产培养基存在污染的风险,与长期细胞培养有关。

耗时:为了产生所需数量的抗体,体外培养往往需要长时间维持。

可扩展性:将研究规模的抗体生产转化为大规模的商业生产是很困难的。因此,在优化生产过程时,必须考虑过程的可伸缩性。

成本:体外生产系统的组成部分(如设备、消耗品和培养基配方)可能非常昂贵。

 

优化策略

 一、优化细胞系

虽然传统的杂交通常用于生产研究抗体,但人类的治疗抗体通常是由重组细胞株克隆和产生的。细胞系的选择严重影响了抗体生产过程的成功。优化重组细胞系通常是抗体生产中最耗时的步骤,需要仔细考虑许多因素。

 

  1. 细胞系起源:哺乳动物细胞是产生大多数重组蛋白的最佳选择,今天生产的所有重组蛋白中大约70%是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系制造的。
  2. 利用宿主细胞系变体和工程细胞系:重组细胞系可以被设计用来调节糖基化和其他转录后修饰,通过引入抗凋亡基因减少细胞死亡,开发诱导系统,使生长阶段与生产阶段分离,具有更强的亲和力和更高的收益率。
  3. 合适的基因表达载体:哺乳动物的表达载体包含了抗体基因和选择标记,以及强启动子和增强子。可以添加额外的序列,以更好的信号输出和分泌目的蛋白。
  4. 最佳的转染方法:钙转染、脂质转染、电穿孔和聚合物转染。
  5. 克隆筛选法:可靠的筛选方法是鉴定最有效的克隆和预估抗体数量和质量的关键。

 

二、优化培养基条件

无论你使用传统的杂交细胞还是重组细胞株,培养基的选择都会影响细胞的生长,从而影响抗体的质量和产量。实验室经常对一系列不同的培养基成分进行检测,以确定最佳的细胞系。

 

  1. 包含动物血清的培养基配方通常不能用于人类治疗,因此,应使用无血清的、化学限定的培养基来避免动物来源产品与抗体的共纯化。
  2. 添加剂和营养素的加入可提高单体外克隆抗体的生产。补充剂可能包括生长因子、生长抑制剂、自分泌因子和环核苷酸。目前的重组细胞系的生产过程通常包括调节转录后修饰的添加剂,这对抗体的功能很重要。某些添加剂也有助于提高产量。
  3. 在某些情况下,高渗透压可能刺激抗体产生。可以通过在培养基中测试不同的盐和糖浓度来进行研究,并选择最佳抗体产量的方法。
  4. 基础培养基减少葡萄糖和谷氨酰胺的浓度可防止某些不良代谢副产物的积聚,如氨和乳酸盐,从而延长细胞存活时间。
  5. 培养基中的氨基酸作为细胞代谢的优先能量来源,增加单克隆抗体的产量,减少细胞对碳水化合物的依赖。
  6. 某些细胞系对它们的生长和生产阶段有不同的要求,考虑双培养基策略,在利于生长的培养基中培养细胞以促进生长,然后转换成另一种培养基以优化蛋白质生产。但是这种方法可能会增加系统的复杂性和成本。
  7. 确定标准化的物理化学培养条件(如pH、温度、O2和CO2水平和增氧能力),以获得最佳的培养基性能,增强抗体的产量。

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