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在病毒诊断中，核酸扩增测试，例如逆转录PCR反应 (RT-PCR)，可以及早发现和识别逆转录病毒导致的传染病。在这个标准 PCR 过程中，作为初始模板的 mRNA 首先被逆转录为互补 DNA (cDNA)，然后通过 PCR 扩增以进行下游分析。相对于其他测量 mRNA 的技术，例如 Northern Blot、RNAse 保护分析或荧光原位杂交，RT-PCR 在检测任何基因的 RNA 转录物时明显更加有优势。RT-PCR 已成为检测病原体的常规方法，包括流感病毒、肠道病毒、冠状病毒 (SARS-CoV-2)、埃博拉病毒和 HIV等。

 

 

1. 逆转录病毒

逆转录病毒是一种遗传物质为RNA的病毒，与其他病毒类似，逆转录病毒通过劫持细胞中的细胞器进行自身的复制。病毒感染细胞后，逆转录病毒利用其自身的逆转录酶从其 RNA 基因组中合成双链 DNA。新合成的病毒 DNA 被整合到宿主细胞基因组中，然后病毒的遗传物质作为宿主细胞 DNA 的一部分一起进行复制。

在人类历史上，出现过许多导致严重的疾病的逆转录病毒：HIV-1 和 HIV-2 等逆转录病毒会导致艾滋病，而人类 T 淋巴细胞病毒会导致白血病（即血癌）和脱髓鞘病。这些严重的疾病和新出现的传染病的持续威胁，再次证实了开发能够检测低密度感染的快速诊断工具是多么的有必要的，用于早期检测逆转录病毒感染的最完善的工具之一是核酸扩增检测。

 

2. 核酸扩增试验

核酸扩增检测旨在检测少量特定核酸序列，以识别特定病原体，通常是病毒或细菌。核酸扩增测试不是检测抗原或抗体（血清学分析的目标），而是针对并检测遗传物质，例如 DNA 或 RNA。遗传物质的检测允许在血清转化之前对感染进行早期诊断，在此期间，特异性抗体针对病原体产生并在血液中可检测到。常见的核酸扩增检测包括RT-PCR、链置换试验 (SDA) 或转录介导试验 (TMA)。

逆转录 PCR (RT-PCR)

逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 是一种用于检测和定量 mRNA 表达水平的高度灵敏的技术。在 RT-PCR 中，首先使用逆转录酶将 RNA 模板逆转录为互补 DNA (cDNA)。这种依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶在逆转录引物、脱氧核苷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP）的帮助下，催化从其各自的目标 RNA 序列合成 cDNA。然后将 cDNA 用标准 PCR 程序（变性、退火和延伸）进行指数扩增然后再进行检测。RT-PCR 已被用于多种应用，包括基因表达分析、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。

RT-PCR产物的定量一般可分为两类：终点RT-PCR和定量RT-PCR（RT-qPCR）。

表1. 用于 PCR、RT-qPCR 和RT-PCR 的脱氧核苷酸 (dNTP)

 

3. 终点RT-PCR

终点 RT-PCR 是分析基于 PCR 反应的平台期，用于在 PCR 反应的所有循环完成后分析扩增产物的技术，在该方法中，扩增子通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用 DNA 结合染料（如溴化乙锭 (EtBr)）进行可视化，用来确定 500至30,000 bp 范围内的 DNA 分子大小。虽然 EtBr 是最常用的 DNA 可视化染料，但它具有致突变性和吸入毒性。因此，可以考虑使用更安全、更环保、无毒的替代品，例如 Gelite™ X100（货号：17706）、Helixyte™ Green（货号：17590）、Helixyte™ Gold（货号：17595）、Gelite™ Green（货号：17589 ) 或 Gelite™ Orange（货号：17594）。

表 2. 终点RT-PCR的优缺点及应用

 

表 3. 用于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳的核酸染料

 

4. RT-qPCR

在定量 RT-PCR (RT-qPCR) 中，荧光标记的核苷酸或序列特异性荧光探针被整合到 RT-PCR 反应中，允许在 PCR 的指数阶段实时测量目的基因的浓度。实现了将扩增和检测结合到一个步骤中，RT-qPCR 提供了更高的精确度和准确度。由于拥有更高的灵敏度，RT-qPCR 通常用于分析基因表达中的 mRNA、检查逆转录病毒的存在以及验证通过阵列分析获得的结果。

 

墙裂推荐：用于 RT-qPCR 的 Helixyte™ Green染料

 

RT-qPCR 使用荧光 DNA 嵌入染料，例如 Helixyte™ Green（货号17591) 为实时检测和定量 PCR 扩增子提供了最简单、最经济的方法。Helixyte™ Green 可以与双链 DNA (dsDNA) 结合，并在激发时发光。 连续扩增循环使目的基因的浓度增加，Helixyte™ Green 的荧光强度也会增加，其程度与每个 PCR 循环中存在的 dsDNA 量成正比。Helixyte™ Green 是EtBr 更安全的替代品，也拥有更高的灵敏度，可用于检测任何 dsDNA 序列的扩增。（Note：由于 DNA 嵌入染料会与所有的 dsDNA 结合，例如引物二聚体和非特异性产物，因此使用精心设计的引物以避免扩增非特异性序列非常重要。）

 

表 4. 用于 qPCR 的双链 DNA 结合染料

 

5. 用于 RT-qPCR 的 TaqMan® 探针和分子信标

在基于探针的 RT-qPCR 中，荧光标记的目的基因特异性探针可用于实时监测 DNA 的扩增。这种方法具有极高的特异性，并可以在单个反应中同时检测多个目标，在诸多的基于探针的 RT-qPCR 检测方法中，TaqMan® 探针和分子信标是使用最广泛的，两者都依赖于 Förster 共振能量转移 (FRET) 来产生荧光信号：TaqMan® 探针依赖于Taq DNA 聚合酶的 5'-核酸酶活性，与靶标互补的短寡核苷酸序列在 5' 端用荧光报告染料标记（见表 5），在 3' 端用非荧光猝灭染料标记（见表 6），在 PCR 循环期间，引物和探针与靶标退火，当 Taq DNA 聚合酶与探针上游的引物结合并延伸时，杂交的探针被水解，含有报告染料的片段被释放，然后就可以检测荧光信号，产生的荧光信号量与产生的 qPCR 产物量成正比。

 

与 TaqMan® 探针一样，分子信标在 5' 端用荧光报告染料标记，在 3' 端用非荧光淬灭染料标记。然而，该方法不依赖于Taq DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性来产生信号，而是分子信标在整个扩增过程中都保持完整，在没有靶标的情况下，分子信标由于其自我互补的茎环结构而依然保持在“发夹”确认状态，这使荧光报告基因和淬灭染料彼此靠近，防止探针发荧光。当分子信标与其靶标杂交时，荧光报告基团和淬灭基团分离，报告染料在特定波长处发光。

我们提供一系列的染料标记的亚磷酰胺和染料 CPG 支持物，便于开发 FRET 寡核苷酸、TaqMan® 探针和分子信标。染料类型包括各种经典染料，例如 FAM、HEX、TET 和 JOE，以及全新的寡标记染料，例如 Tide Fluor™ 和 Tide Quencher™ 染料。

表 5. 用于标记qPCR 探针的报告荧光染料

 

表 6. 用于标记qPCR 探针的淬灭染料

 

表 7. 用于开发 FRET 寡核苷酸的推荐FRET 荧光对

 

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