Cytoskeleton新品氧化Actin，你值得拥有

前情回顾：Actin甲硫氨酸氧化：动力学调节的下一个层次

前面我们介绍了肌动蛋白氧化的相关研究进展，这个领域的研究相对来说还比较少还有许多值得探索的空间，细胞骨架研究领域的资深供应商Cytoskeleton开发了几款新品Actin，致力于给细胞骨架研究者们提供更好的产品，以助力他们进行更深层次的研究，下面我们首先来了解一下相关的背景知识：

芘标记的Actin用于肌动蛋白聚合检测：

肌动蛋白聚合程度的测定是评价化合物对肌动蛋白功能影响的一种快速有效的方法，到目前为止，最通用、最敏感、最容易使用的方法是Fluorescence enhancement of pyrene conjugates——芘共轭物的荧光增强法来判断聚合程度，它包括将你的对照品和测试品与少量的芘结合的肌动蛋白混合，然后进行聚合，芘-肌动蛋白单体结合成聚合物形式后，荧光会增强到20倍。

图2. 芘标记的Actin聚合过程中的荧光增强。通过添加Actin聚合缓冲液（BSA02），芘标记的肌肉肌动蛋白在96孔板中聚合 ，1小时内每隔30秒扫描一次荧光信号。聚合的 F-actin与未聚合的芘标记G-actin和对照缓冲液相比荧光增强10倍。

肌动蛋白聚合分为三个阶段，成核期（lag phase）、生长期（growth phase）和稳定期（steady state phase），如图2所示，聚合程度由稳定期的荧光水平来表示。

MICAL（MIC01）是一种细胞内的黄酮蛋白单加氧酶，从昆虫到哺乳动物都很保守，它在氧化还原（redox）反应中起催化剂的作用。Terman的小组阐明了MICAL与F-actin之间存在相互作用：在使用NADPH作为辅因子情况下，MICAL可氧化肌动蛋白上的Met44和Met47（第44位和47位的甲硫氨酸）位点，Cytoskeleton已经从细菌表达系统生产并纯化了人类MICAL1蛋白，重组蛋白被N-末端6xHis标记，由全长蛋白的Redox和CH结构域（aa：1-612）组成，验证研究表明，MICAL1可以氧化肌动蛋白，从而在蛋白水解测定中将枯草杆菌蛋白酶A的剪切减少90％以上。

MsrB2（MB201）是一种蛋白质，可以还原肌动蛋白上第44位和47位甲硫氨酸（M44和M47），MsrB2在还原肌动蛋白的过程中被氧化，可通过DTT还原再生，当肌动蛋白的M44位点被氧化时，其聚合能力显著降低；相反，当被氧化的肌动蛋白在M44位点被还原时，其聚合能力会恢复，肌动蛋白聚合试验可用于检测MICAL氧化肌动蛋白与MsrB2还原肌动蛋白对Actin聚合的影响。

枯草杆菌素A是一种蛋白酶，已被证明能在M47和G48之间特异性地切割肌动蛋白。当肌动蛋白的M47位点被MICAL氧化时，枯草杆菌蛋白酶A切割的效率显著降低；反之，当肌动蛋白的M47位点被MsRB2（+DTT）还原时，枯草杆菌蛋白酶A的切割效率显著提高。因此，枯草杆菌素A可通过评估切割与未切割的肌动蛋白，以确定MsrB2活性及对M47和M44的还原效率。

MICAL-1对Actin聚合的影响分析：

	MICAL-1（MIC01）蛋白纯度测定 :   通过在4- 20％Tris-甘氨酸凝胶中电泳分离10μg MICAL-1蛋白样品，并用考马斯亮蓝染色, 使用Precision RedTM蛋白测定试剂进行蛋白定量。
	MICAL-1氧化的肌动蛋白的枯草杆菌蛋白酶A检测：   肌动蛋白（AKL99）对照组 NADPH（400 m M）+Actin处理组 MICAL（0.076 m M）+Actin处理组 NADPH+ MICAL +Actin处理组 然后全部用枯草杆菌蛋白酶A(不)处理15min结果： 在NADPH和MICAL共同存在的情况下， 用枯草杆菌蛋白酶A处理后，被切割的肌动蛋白表达量显著下调，NADPH或MICAL单独存在时与阴性对照无显著差异。
	MICAL-1对Actin聚合的影响： 用MICAL（MIC01） + NADPH处理不同浓度的天然肌动蛋白（AKL99），然后将样品在超速离心机中100,000 g离心1.5 h。 结果：MICAL + NADPH处理后，沉淀（pel,, 主要为actin聚合体）蛋白表达量显著高于上清液（sup, 主要为actin单体）。 表明Actin浓度为0.1g / ml时，MICAL + NADPH能将肌动蛋白聚合程度降低50%；浓度为0.4m g / ml时，MICAL + NADPH能将肌动蛋白聚合程度降低约20%。
	MICAL-1对Actin聚合的影响（荧光检测） ：   芘标记的肌动蛋白（AP05）作为对照组 NADPH处理 MICAL（MIC01）处理 NADPH + MICAL（MIC01）处理结果：NADPH + MICAL（MIC01）共同处理，聚合曲线荧光值显著降低.，表明NADPH + MICAL共同处理才能降低肌动蛋白聚合程度。

MICAL氧化Actin与天然Actin对比分析： 

	MICAL氧化Actin与天然Actin的枯草杆菌蛋白酶处理对比：   将芘标记的肌动蛋白（AP05）和MICAL氧化的芘标记肌动蛋白（MXAP95）稀释至0.1 mg / ml（2.3 mM）。然后用枯草杆菌蛋白酶A（不）处理15min， 结果：与天然肌动蛋白相比，MICAL氧化的肌动蛋白，用枯草杆菌蛋白酶A处理后，被切割的肌动蛋白表达量显著下调。
	氧化Actin与天然Actin的肌动蛋白聚合分析对比：   不同浓度芘标记的天然肌动蛋白（AP05）和MICAL氧化肌动蛋白与聚合缓冲液一起孵育。 结果： 浓度为0.05g / ml时，MICAL氧化肌动蛋白不会聚合，而天然肌动蛋白则能够很好地聚合； 浓度为0.1m g / ml时，MICAL氧化肌动蛋白可聚合至天然肌动蛋白的约50％。 表明MICAL氧化肌动蛋白临界聚合浓度比未修饰形式更高。

MICAL氧化Actin的MsrB2处理分析：

	MsrB2蛋白纯度测定：   通过在4-20％tris-甘氨酸凝胶中的电泳分离10μg MsrB2蛋白样品，并用考马斯亮蓝染色。使用Precision Red TM蛋白测定试剂进行蛋白定量。
	MsrB2处理的氧化Actin的枯草杆菌蛋白酶A分析： MICAL氧化的肌动蛋白（MetO肌动蛋白）（Cat＃MXA95）对照组 DTT（10 mM）处理组 MB201（0.3 m M）处理组 DTT+MB201混合处理组 结果：MsRB2（Mb201）+DTT还原的氧化型肌动蛋白将增强枯草杆菌蛋白酶A切割氧化Actin，而DTT单独作用不会影响枯草杆菌蛋白酶的切割。
	MsrB2对氧化Actin聚合的影响 ：   用MsRB2 + DTT处理不同浓度的MICAL氧化的肌动蛋白（MetO肌动蛋白），然后将样品在超速离心机中100,000 g离心1.5 h。结果：MsRB2 + DTT处理后，沉淀（pel, 主要为actin聚合体）蛋白表达量显著高于上清液（sup, 主要为actin单体），表明MsRB2 + DTT能还原氧化的Actin，从而增强肌动蛋白的聚合。
	MsrB2对氧化Actin聚合的影响（荧光检测） ： MsRB2（Mb201）+DTT处理MICAL氧化的芘标记的肌动蛋白（MXAP95）后，荧光信号会在1小时内恢复到与天然芘标记的肌动蛋白相当的水平（AP05），而DTT单独处理Actin聚合能力不会恢复。

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Cytoskeleton公司成立于1993年，专注于生物化学和细胞过程研究中的纯化蛋白和便捷试剂盒开发与生产。公司提供药物筛选、信号转导、蛋白质转录后修饰（PTM）、细胞骨架研究相关的系列试剂盒和产品，尤其以细胞骨架相关研究见长，既能满足于样品较少的科学研究，也可以用于小规模筛选研究和高通量大规模筛选研究。此外，公司还提供微管蛋白，肌动蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等现有产品的药物筛选服务。

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