文献解读丨论一种蛋白的自我修养

 

Abbikine产品Dylight 594, Goat Anti-Mouse IgG (A23410, Abbkine,Wuhan, China);Dylight 488, Goat Anti-Rabbit IgG (A23220, Abbkine,Wuhan, China))
英文名ALBA protein complex reads genic R-loops to maintain genome stability in Arabidopsis
中文名拟南芥的ALBA蛋白复合物读取基因R环以维持基因组稳定性
作者单位北京大学生命科学院和北京-清华生命科学中心
研究方向蛋白和植物基因
杂志名称MOLECULAR BIOLOGY (2019)
影响因子13.05

 

研究背景

 

R环是由DNA-RNA杂种和置换的单链DNA(ssDNA)组成的天然染色质结构。 R环普遍存在于细菌,酵母,动物和植物中,并在调节基因表达,染色质结构和DNA修复中起关键作用。 在酵母中,R环的形成会刺激转录区域的复制缺陷。 在哺乳动物中,R环的形成有助于转录终止,组蛋白赖氨酸甲基转移酶的异染色质保留和有丝分裂染色体分离。 在植物中,R环调节基因表达和植物发育。

 

但是,R环对基因组稳定性构成威胁,因为被置换的ssDNA易受核苷酸变化和链断裂的影响。 R环也是破坏DNA复制的结构性障碍,在转录-复制冲突中,R环会诱导DNA损伤和基因组不稳定。核糖核酸酶(RNase)H酶和RNA-DNA解旋酶可溶解R环,并防止由持久R环形成引起的DNA损伤和基因组不稳定。复制蛋白A(RPA)是一种ssDNA结合蛋白,可作为R环的传感器来募集RNase H1,以去除R环并抑制人类细胞系中的基因组不稳定。许多蛋白质,例如酵母中的Npl3和人细胞中的THO-TREX复合物以及BRCA,可防止R环形成或稳定化,从而保护基因组稳定性。最近的全基因组图谱显示了酵母中由R环引起的DNA损伤,即使具有R环,许多基因组区域也不容易受到DNA损伤,这表明除降低R环水平外,还存在其他保护机制DNA被损坏。

 

Alba蛋白是小的二聚体DNA / RNA结合蛋白,其作用已在古细菌中得到了最好的表征。 结构和分子研究表明,Alba二聚体以序列独立和协作的方式与DNA结合。 在低蛋白质-DNA比率下,Alba二聚体与相邻DNA双链体上的Alba二聚体相互作用并桥接两个DNA双链体,而在高蛋白质-DNA比率下,Alba二聚体与DNA双链体并排结合并固定DNA。 阿尔巴蛋白在塑造染色质结构中的作用类似于组蛋白。 古细菌Alba蛋白以与检测DNA相似的亲和力结合RNA,并可能调节RNA的加工。 对其他生物的研究表明,Alba蛋白还通过与RNA结合来调节RNA的稳定性和蛋白翻译。 但是,尚不清楚Alba蛋白在植物和哺乳动物中的功能。

 

在这里,我们表征了两个拟南芥ALBA蛋白(AtALBA1AtALBA2)的功能。 AtALBA1和AtALBA2具有不同的核酸结合特性,但它们在细胞核中共定位并形成异二聚体。 基于它们的活性,我们发现它们可以在体外结合R环结构。 在体内,它们优先以具有R环依赖性的方式与具有活跃表观遗传标记的基因区域结合。 AtALBA1或AtALBA2的耗尽会导致植物对DNA破坏剂过度敏感,因为AtALBA1和AtALBA2靶向的R环失去了保护。 我们的发现表明AtALBA1和AtALBA2是保护基因组稳定性的R环阅读器。

 

实验目的

 

由DNA-RNA杂合体和置换的单链DNA组成的R环调节着各种细胞过程。 然而,如何识别细胞R环仍然知之甚少。 在这里,我们报告进化上保守的ALBA蛋白(AtALBA1和AtALBA2)的发现,该蛋白在拟南芥中起基因R环阅读器的作用。 AtALBA1与DNA-RNA杂合体结合时,AtALBA2在体外与R环中的单链DNA结合。 在体内,这两种蛋白质相互作用并共定位于细胞核中,它们以R环依赖性方式优先结合具有活跃表观遗传标记的基因区域。 AtALBA1或AtALBA2的耗尽会导致植物对DNA破坏剂过度敏感。 alba突变体中DNA断裂的形成源自未保护的R环。 我们的结果表明,AtALBA1和AtALBA2蛋白复合物是基因R环阅读器,对拟南芥中的基因组稳定性至关重要。

 

材料与方法

 

  1. 植物培养和条件控制
  2. GFP融合构建体的瞬时表达
  3. 核质分离
  4. Western blot
  5. 分裂荧光素酶互补实验
  6. WB实验
  7. CO-IP实验
  8. 免疫定位实验
  9. 电泳迁移率变动分析
  10. ChIP实验和数据分析
  11. 表观遗传特性分析

 

实验结果

 

  1. AtALBA1和AtALBA2在体外结合R环

 

根据系统发育分析,拟南芥基因组编码六个属于两个不同亚科的Alba蛋白。 Rpp20样亚家族的成员,包括AtALBA1,AtALBA2和AtALBA3,仅具有保守的Alba域,而Mdp2样亚家族的成员,包括AtALBA4,AtALBA5和AtALBA6,具有额外的RGG(Arg-Gly-Gly) 重复序列,通常在调节转录,剪接和翻译的蛋白质中发现。

 

为了研究ALBA蛋白的功能,我们最初开始分析基因家族中最简单的两种蛋白AtALBA1和AtALBA2对不同形式核酸的结合亲和力。为此,我们纯化了AtALBA1和AtALBA2的重组野生型和K30E突变体形式。 K30在位置上对应于古细菌Alba蛋白中的关键DNA结合残基之一(ssoAlba1中的K20和AfAlba2中的K11),在AtALBA1,AtALBA2和其他物种的许多Alba蛋白中均保守。还制备了纯化的AtNDX作为阳性对照。然后,我们使用不同的底物进行了电泳迁移率变动分析(EMSA)。我们的结果表明,野生型AtALBA1-His与单链RNA(ssRNA)和DNA-RNA杂种结合(图1A)。

 

相反,野生型AtALBA2-His与ssDNA和双链DNA(dsDNA)结合(图1B)。与以前的结果一致,AtNDX可以结合ssDNA。由于AtALBA1和AtALBA2与我们设计的所有核酸序列结合,因此它们与核酸的结合被认为是序列无关的。所有观察到的结合都可以用过量的冷探针竞争,并且AtALBA1与DNA-RNA杂种的结合对RNase H消化敏感,表明了结合的特异性。 K30E突变消除了AtALBA1-His和AtALBA2-His的结合活性(图1,A和B),这表明K30残基对于Alba蛋白与DNA,RNA和DNA-RNA杂种的结合非常重要。为了比较AtALBA1和AtALBA2对不同类型核酸的相对亲和力,我们使用Agilent 2100 BioAnalyzer定量了它们的亲和力。我们的研究结果表明,AtALBA1和AtALBA2在体外分别对DNA-RNA杂种和dsDNA具有更高的亲和力。

 

  1. AtALBA1和AtALBA2在细胞核内共聚形成异二聚体

 

接下来,我们研究了AtALBA1和AtALBA2的亚细胞定位。我们在拟南芥原生质体中短暂表达了C末端绿色荧光蛋白(GFP)标记的AtALBA1和AtALBA2(AtALBA1-GFP和AtALBA2-GFP)。在细胞质和细胞核中均观察到AtALBA1-GFP和AtALBA2-GFP。这些结果通过使用转基因植物的亚细胞分级分离实验得到证实。像其他物种的Alba蛋白一样,AtALBA1和AtALBA2形成同型二聚体和异二聚体,这是通过我们的拆分荧光素酶互补和共免疫沉淀测定法确定的。为了可视化由AtALBA1和AtALBA2形成的同型二聚体和异型二聚体的核定位模式,我们对Col-0和F1杂种植物的ALAL1-Myc和ALBA2-Flag转基因植物之间的杂交进行了染色,对AtALBA1-Myc和AtALBA2-Flag进行了染色。

 

AtALBA1和AtALBA2共定位在约92%的转基因核中,如绿色和红色信号重叠产生的黄色信号所示。在所有野生型细胞核中均未检测到除4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)信号外的其他信号,表明我们染色的特异性。 AtALBA1和AtALBA2的共定位与它们的异二聚体一致。

 

  1. AtALBA1和AtALBA2在体外与R -loop结合

 

由于AtALBA1和AtALBA2相互作用且可能在细胞核中异源二聚体,根据我们的EMSA结果,异源二聚体应该能够结合R-环中的DNA-RNA杂种和置换的ssDNA,我们假设AtALBA1和AtALBA2是R环 结合蛋白。 为了验证这一假设,我们使用人工R环底物进行了EMSA。 我们的结果表明AtALBA1和AtALBA2以对RNase H处理敏感的方式结合了人工R环(图1,C和D)。 如预期的那样,阳性对照AtNDX也会结合我们设计的R环。使用Agilent 2100 BioAnalyzer对R环的相对亲和力进行比较后发现,与单独的AtALBA1或AtALBA2相比,AtALBA1和AtALBA2异二聚体对R环的亲和力更大。 总之,这些结果表明AtALBA1和AtALBA2可以在体外结合R环。

 

AtALBA1

图1 AtALBA1和AtALBA2在体外与R -loop结合。

 

  1. AtALBA1和AtALBA2在体内结合R环

 

为了评估AtALBA1和AtALBA2特异性识别植物中R环的可能性,我们首先进行了染色质免疫沉淀(ChIP)与高通量测序(ChIP-seq)结合以鉴定受AtALBA1结合的基因组位点。总共在AtALBA1 ChIP-seq的两个生物学重复中一致地鉴定出2146个结合峰,并且有2060个基因与这些峰相关,约占拟南芥基因的4.63%。这些峰大多数位于基因区域内,并且在整个基因体中观察到AtALBA1富集(图2,A和B)。 AtALBA1优先富集到短于2 kb的基因上(图2C)。对峰区域的组蛋白修饰水平的分析表明,AtALBA1结合与活跃转录的基因(包括H3K9Ac,H3K14Ac,H3K27Ac,H3K4me2和H3K4me3)的组蛋白修饰特征高度一致。未发现AtALBA1结合与抑制性组蛋白标记(例如H3K9me2)之间存在相关性(图2D)。一致地,我们的免疫染色结果表明AtALBA1和AtALBA2的H3K9me1抑制域没有富集(图2E)。对基因表达水平的进一步分析表明,与非AtALBA1结合的基因相比,与AtALBA1峰相关的基因的表达水平明显更高。我们的结果表明AtALBA1更倾向于结合活性基因。

 

AtALBA1

图2 AtALBA1在体内优先与活跃的表观遗传标记的基因体区域结合。

 

为了确定AtALBA2是否与相同的染色质区域结合,我们通过进行ChIP定量聚合酶链反应(qPCR)检查了AtALBA1和AtALBA2在随机选择的基因上的富集。 像AtALBA1一样,AtALBA2在所有检查过的AtALBA1结合基因上都富集,但在非AtALBA1结合基因上却没有。 我们的结果表明AtALBA1和AtALBA2共同占据了染色质区域的一个子集。 当分别在alba1-1alba2-1背景中使用AtALBA1-Flag和AtALBA2-Myc转基因植物时,AtALBA1-FLAG和AtALBA2-MYC的AtALBA1结合基因不富集,这为AtALBA1和AtALBA2在靶位点的异源二聚化提供了进一步的证据。

 

然后,我们使用拟南芥中可用的全基因组R环数据分析了AtALBA1结合基因中R环的存在与否。 我们发现AtALBA1结合与R环的存在之间存在强正相关(图3A)。 具体而言,发现有75.5%的AtALBA1结合基因带有R环。 带有有义和反义R环(重叠R环)的基因在AtALBA1结合的基因中显着富集(图3B)。 为了进一步确认AtALBA1和AtALBA2在体内特异性结合R环,我们在RNase H处理后进行了ChIP实验。 我们的ChIP-qPCR结果表明AtALBA1和AtALBA2与随机选择的基因的结合对RNase H消化敏感。

 

ALBA蛋白复合物

图3 AtALBA1和AtALBA2的结合与R-loop的存在相关。

 

  1. AtALBA1和AtALBA2保护基因R环免受DNA损伤

 

R-环是基因组不稳定的来源。保护基因R-环区免于受损是特别重要的。尽管AtALBA1和AtALBA2不能调节R环水平,但我们接下来测试了AtALBA1和AtALBA2作为基因R环结合蛋白是否可以保护基因R环免受DNA损伤。用或不用DNA烷基化剂甲磺酸甲酯(MMS)处理Col-0和alba单突变体和双突变体。首先,我们使用抗H2AX抗体通过免疫染色检测了H2AX病灶。在未经MMS处理的Col-0和alba突变体中,几乎无法检测到H2AX病灶。用MMS处理的白单突变和双突变中gH2AX病灶水平显着增加(图4,A和B)。 alba突变体中gH2AX病灶的模式类似于g辐照诱导的模式(图4A)。我们的结果表明,AtALBA1和AtALBA2都是维持基因组稳定性所必需的。

 

第二,我们进行了RT-qPCR检测RAD51和BRCA1的表达水平,这些表达水平响应DNA损伤而被激活。我们的结果表明,在进行MMS处理后,alba单突变体和双突变体中RAD51和BRCA1的表达水平显着增加,并且该分子表型可以在其天然启动子的控制下由AtALBA1或AtALBA2转基因进行补充。

 

第三,通过测量植物的新鲜重量来测量植物的生长,结果表明,单突变体和双突变体比Col-0植物对MMS更为敏感(图4C)。值得注意的是,通过MMS处理可以提高AtALBA1和AtALBA2的表达水平。 MMS处理后,AtALBA1和AtALBA2表达的增加并未导致AtALBA1和AtALBA2的定位模式改变。

 

为了确定MMS处理是否诱导R环水平的变化,引起alba突变体对DNA损伤的高度敏感性以及AtALBA1和AtALBA2表达的诱导,我们分析了使用和不使用MMS处理的植物中的R环水平。尽管我们不能排除MMS治疗后特定基因座的R环水平发生改变的可能性,但MMS处理的总R环水平保持不变。

 

MMS,拟南芥

图4 AtALBA1或AtALBA2的缺失导致植物对MMS的高度敏感性。

 

创新点

 

在这项研究中,我们发现AtALBA1和AtALBA2是拟南芥中的R环阅读器。它们形成异二聚体并在基因区域结合R环的子集。它们的结合保护基因R环区域不受损害(图4E)。已经发现古细菌和其他生物中的Alba蛋白质可调节染色质结构,RNA代谢和蛋白质翻译。在植物中,AtALBA1和AtALBA2已进化为结合R环并维持基因组稳定性。 AtALBA1和AtALBA2的独特之处在于它们可以分别结合DNA-RNA杂种和ssDNA,并且可以异源二聚。此特性使AtALBA1和AtALBA2可以绑定R环的两个部分。我们的EMSA和ChIP结果表明它们结合了R环。 AtALBA1对DNA-RNA杂种的亲和力高于对ssRNA的亲和力。因此,AtALBA1优先识别R环。但是,AtALBA2对ssDNA的亲和力低于对dsDNA的亲和力。要特异地绑定R环,可能需要AtALBA1将其募集到R环。在alba1-1alba1-2突变体背景中,AtALBA2并未富集与R环重叠的基因,表明AtALBA1和AtALBA2结合。

 

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