Westernblot 是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
然而我们在做 WB 实验时总会遇到各种各样的问题,今天小艾为大家整理了常见的 WB 实验问题与处理方案。如有难题或者,欢迎联系艾美捷科技服务团队:400-6800-868。
上期回顾:艾美捷-WB常见问题-50问【上】
—— 续 ——
27、做组织样品的 western 的时候,怎样处理样品?
答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。
28、问大分子量蛋白 200KD,在做 western 要注意什么呢?
答:做 200kd 蛋白的 WesternBlot 时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。
29、有什么方法可以提高上样量?
答:a)可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;b)用 5 倍的上样缓冲液来稀释变性
30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求?
答:上样量要根据实验的要求来定,如果要求是定量和半定量的 WesternBlot 则上样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系,尽量多上就行了,但是不要超载。
31、一抗,二抗的比例是否重要?
答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。
32、要做磷酸化某因子 WesternBlot,其二抗有何要求?
答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用 HRP 标记的二抗。
33、免疫组化和 WesternBlot 可以用同一种抗体吗?
答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
34、WesternBlot 中抗体的可以重复应用吗?
答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用 2-3 次。稀释后应在 2-3 天内使用,4 度保存,避免反复冻融。
35、在做 WesternBlot 时,PVDF 膜用甲醇浸泡的目的?
答:PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗?
答:可以。
37、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好,为什么?
答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢,你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。
38、做 WesternBlot 时,同样的抗体免疫组化能做出,而 WesternBlot 却不能?
答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做 WesternBlot 和免疫组化。
39、如果是 6×8 转印膜,要加多少一抗?
答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为 3-5ml。
40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。
答:无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?
答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了;也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂。
42、蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小 21KD,中至 66KD,大至 170KD,可以一次做好吗?
答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd 和 66kd 可以一起转,12%SDS-PAGE,湿转 120mA,45-60min就可以了,可以根据你实验室的经验调节;170kd 用 7%SDS-PAGE,200mA90-120min。
43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么样解决?
答:可以考虑:转移缓冲液中加入 20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和 NC 膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度 0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的 NC 膜(0.2 微米)。
44、我用的是可视 marker,但是电泳总跑不全 8 条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过 8%,10%,12%,都是这样。marker 是新买的。
答:一般来说,是小分子量 Marker 跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
45、是否 WesternBlot 实验半定量一定要加 ACTIN 内参?
答:对于发表文章的实验最好加内参,实验严谨。
46、核内抗原 WesternBlot 内参选择什么合适?
答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出你要的内参。
47、做半定量 WesternBlot,内参β-actin,GAPDH 哪个好?
答:选用 beta-actin 就可以。
48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?
答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。
49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的 TBST 脱脂奶粉”,其中 TBST 最后那个 T 是 Tween 吗,浓度多大?
答:是 Tween,配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaCl:8g,Trisbase:2.42g 加水 800ml 溶解,加 500-1000ul 的 Tween-20,用 HCl 调节 pH 至 7.4,加水定容至 1L。
50、封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在 4 度下?
答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后 4 度过夜。
51、请问一下 PVDF 膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?
答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF 膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。
52、怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?
答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:(1)电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶 55v,分离胶 75v 就能跑得很好。(2)胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶.
53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?
答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去了。
54、电泳中常出现的一些现象:
- ︶条带呈笑脸状原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高。
- ︵条带呈皱眉状原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。
- 拖尾原因:样品溶解不好。
- 纹理(纵向条纹)原因:样品中含有不溶性颗粒。
- 条带偏斜原因:电极不平衡或者加样位置偏斜。
- 条带两边扩散原因:加样量过多。
55、Westernblot 结果中背景较高可能的原因及建议:
- 膜封闭不够延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液。
- 一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。
- 一抗孵育的温度偏高建议 4℃结合过夜。
- 选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比 PVDF 膜低。
- 膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
- 检测时曝光时间过长减少曝光时间。
56、Westernblot 结果中杂带较多可能的原因及建议:
- 目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。
- 目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
- 样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。
- 上样量过高,太敏感适当减少上样量。
- 一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
- 一抗不纯纯化抗体
- 一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
57、Westernblot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议:
- 检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。
- 检测样本低表达目的蛋白提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
- 转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。
- 抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
- 一抗孵育时间不足建议 4℃结合过夜。
- 二抗与一抗不匹配选择针对一抗来源的种属的抗体。
- 洗膜过度洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用 0.1%的弱去垢剂 Tween-20。
58、其它现象:
- 膜上多处出现黑点或黑斑原因:抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
- 反白(条带显白色)原因:目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
- 蛋白分子量偏低或偏高原因:胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶。
59、安全问题:
操作有毒试剂时,带手套和口罩,且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。