细胞内pH怎么测?荧光pH探针来帮忙

 

细胞内pH在各种细胞事件中起重要的调节作用,包括细胞生长,钙调节,酶活性,受体介导的信号转导,离子转运,内吞作用,趋化作用,细胞粘附等等。借助pH敏感的荧光指示剂,研究人员能够以更高的灵敏度、空间分辨率、采样密度来监控活细胞内的pH波动。

 

通常,细胞的细胞内pH在其各个细胞区室之间会有所不同。例如,胞质溶胶的pH值介于6.8至7.4之间,而酸性细胞器(如溶酶体)的pH值介于4.5至6.0之间。因此,选择pH指示剂时,重要的是使其酸度系数(pKa)与实验系统的pH相匹配,我们提供多种荧光pH指示剂,pH指示剂葡聚糖结合物和其他试剂,用于生物系统中的pH的检测。
 

1. 近中性pH的检测

 

BCECF及其膜渗透性AM酯是用于测量细胞内pH的最广泛使用的荧光pH指示剂。它的pKa约为6.98,非常适合测量各种细胞类型的胞质中的pH变化,以及监测近中性环境中的pH变化。BCECF在〜504 nm处有一个最大吸收,在〜440 nm处有一个等吸收点,在〜527 nm处有最大发射。尽管BCECF具有双重激发的比值特性,但一些特性使比值成像不理想。其等吸收点与最大激发之间距离较大,细胞内保留性较差以及在440 nm处的弱吸收,都导致其信噪比较低。此外,BCECF以异构体的复杂混合物形式提供。

 

RatioWorks™BCFL,BCECF的高性能替代产品

 

RatioWorks™BCFL是AAT Bioquest设计的新型比值型指示剂,用于优化BCECF的不良性能和异构变异性,与BCECF相似,RatioWorks™BCFL的pKa约为7,最大吸收在503 nm处,最大发射在528 nm处。但是,RatioWorks™BCFL具有约454 nm的等吸收点,等吸收点的这个红移非常适合比值成像,因为它使RatioWorks™BCFL产生的信噪比明显高于BCECF。

 

RatioWorks™BCFL比值型成像技术使细胞内pH值测定基本上独立于几个可变因素,包括染料浓度,光程长度,细胞渗漏和光漂白速率。RatioWorks™BCFL可以作为不渗透膜的酸使用,也可以作为胺反应性琥珀酰亚胺酯用于标记抗体和蛋白质。

 

BCFL激发光谱 BCFL发射光谱

 

RatioWorks™BCFL的主要功能

  • 适用于细胞内pH的单波长成像和比值型成像
  • 信噪比较BCECF高
  • 改善了细胞保留能力,将背景干扰降至最低
  • 单一异构体设计可提供更一致和可重现的结果
  • 适用于荧光显微镜,流式细胞仪和基于荧光酶标仪的测定

 

Ratio标准曲线

 

图1. 使用RatioWorks™BCFL,AM(Cat# 21190)和BCECF,AM(Cat# 21202)产生的标准曲线。将Hela细胞与5 µM RatioWorks™BCFL,AM在37°C下孵育30分钟。用Spexyte™ Intracellular pH Calibration Buffer Kit(Cat# 21235)中的细胞外缓冲液固定细胞内pH在4.5-8.5之间,取4个数据点的平均值,并用4参数拟合曲线,得到pH 6到8的标准曲线。

 

RatioWorks™BCFL PH6.0 RatioWorks™BCFL PH8.5
pH 6.0 pH 8.5

图2. 用RatioWorks™BCFL,AM标记的Hela细胞。将Hela细胞与5 µM RatioWorks™BCFL,AM(Cat# 21190)在37°C 下孵育30分钟。使用显微镜FITC滤光片捕获图像。将BCFL,AM溶液与Hela细胞一起温育,结果显示RatioWorks™BCFL,AM和染色的细胞质均被均匀摄取。

 

表1. 接近中性pH环境的比值型荧光pH探针

指示剂 Ex(nm) Em(nm) pKa 规格 货号
RatioWorks™BCFL,AM 454、503 528 〜7 1mg 21190
RatioWorks™BCFLAcid 454、503 528 〜7 1mg 21189
RatioWorks™BCFL,SE 454、503 528 〜7 1mg 21191
Cell Meter™荧光细胞内pH检测试剂盒 430、505 535 〜7 1000 Tests 21180
CytoFix™BCECF,AM *长期细胞pH示踪剂* 440、504 527 〜6.98 1mg 21202
BCECF,AM 440、504 527 〜6.98 1mg 21202
BCECF,AM *超纯级* 440、504 527 〜6.98 20x50 µ 21203
BCECF acid * CAS#:85138-49-4 * 440、504 527 〜6.98 1mg 21201

2. 酸性pH检测和内吞

嗜酸探针,例如PDMPO和AAT Bioquest Protonex™染料,具有独特的特性,非常适合测量活细胞中偏酸性的细胞器的pH。作为弱碱,由于质子化这些染料能够选择性地在溶酶体和其他酸性隔室内积累。这种质子化不仅减少了背景干扰,还激活了其pH依赖性的荧光。

 

RatioWorks™PDMPO,双重激发|双重发射比值型pH探针

RatioWorks™PDMPO是具有酸性双激发和双发射pH探针, 它的pKa〜4.47和独特的pH依赖性荧光是测量酸性细胞器pH的理想选择。在接近中性的条件下,当以最大激发光(〜333 nm)激发时,RatioWorks™PDMPO会在〜450 nm处发出强烈的蓝色荧光。然而,在更酸性的环境中,该荧光在〜550 nm处迅速转变为深黄色。RatioWorks™PDMPO在〜386 nm处也表现出二次激发最大值。这使得能够在配备有紫色激光的流式细胞仪上进行细胞内pH测量。RatioWorks™PDMPO已成功地用作生物硅化过程中的示踪剂,并已广泛应用于二氧化硅相关研究中。

 

PDMPO激发光谱 PDMPO发射光谱
PDMPO激发光谱 PDMPO发射光谱

 

Protonex™染料,酸性pH指示剂

 

Protonex™Green 500和Protonex™Red 600是AAT Bioquest开发的新型pH敏感荧光染料,用于监测酸性细胞区室(例如内体和溶酶体),从而减少了信号变异性并提高了准确性。在接近中性的环境中,Protonex™染料基本上是无荧光的。直到暴露在酸性环境中,Protonex™染料的荧光强度才会增加。Protonex™Green 500的最佳激发和发射最大值分别为〜445 nm和〜503 nm,而Protonex™Red 600在〜575 nm处激发并在〜597 nm处发射。Protonex™染料可以作为胺反应性琥珀酰亚胺酯用于标记蛋白质和抗体,也可以与葡聚糖或乳胶珠偶联以研究内吞途径。

 

Protonex™Green 500激发光谱 Protonex™Red 600发射光谱
Protonex™Green 500激发光谱 Protonex™Red 600发射光谱

 

Protonex™染料的主要特点

  • Protonex™Green 500和Protonex™Red 600的pKa约为6.5
  • Protonex™染料在中性pH下不发荧光,随着酸化作用荧光强度增加
  • 成功追踪活细胞内化作用并监测吞噬和内吞途径
  • 在中性pH值下染料荧光最弱,无需清洗步骤
  • 适用于与其他荧光染料和缀合物的多重分析
  • 用于荧光显微镜,流式细胞仪,荧光计等

 

图3.通过Protonex™Red 600-Latex珠缀合物Cat# 21209检查了RAW 264.7细胞中的吞噬作用。将RAW 264.7细胞与Protonex™600 Latex Beads在生长培养基中孵育4小时。CytoTrace™Green CMFDA(Cat# 22017)用于追踪活细胞。使用Keyence荧光显微镜拍摄图像(20X)。

 

Protonex™染料

 

表2.用于酸性pH环境的比值型和单波长荧光pH指示剂

指示剂 Ex(nm) Em(nm) pKa 规格 货号
RatioWorks™PDMPO,AM 333 450、531 约4.47 1mg 21204
RatioWorks™PDMPO Dextran * 10,000 MW * 333 450、531 约4.47 1mg 21211
RatioWorks™PDMPO,SE 333 450、531 约4.47 1mg 21210
Protonex™Green 500 445 503 约6.5 1mg 21215
Protonex™Green 500 WS 445 503 约6.5 1mg 21218
Protonex™Green 500,SE 445 503 约6.5 1mg 21216
Protonex™Green 500葡聚糖 445 503 约6.5 1mg 21217
Protonex™红色600 575 597 约6.5 1mg 21207
Protonex™Red 600,SE 575 597 约6.5 1mg 21208

 

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