摘要：微RNA作为关键的转录后调节因子，在骨骼肌发育中起着不可或缺的作用。我们先前的研究表明，MiR-34b-5p和IGFBP2可能在骨骼肌生长中发挥潜在作用。本研究旨在探讨MiR-34b-5p和IGFBP2在肌发生中的作用及调控机制。在本研究中，双荧光素酶报告法和Western blot分析表明，IGFBP2是MiR-34b-5p的直接靶点，流式细胞仪分析和edu分析表明，MiR-34b-5p能抑制成肌细胞的细胞周期进程，MiR-34b-5p能促进成肌细胞的形成。通过促进MYHC的表达。相反，IGFBP2的过度表达显著促进了成肌细胞的增殖，阻碍了肌管的形成。总之，我们的结果表明，MiR-34b-5p可以通过靶向IGFBP2介导成肌细胞的增殖和分化。
1.引言
微RNA（micrornas）是一种小的非编码RNA，通常能结合到3’utr（3’-非翻译区，3’utr）的mRNA，并作为内源性翻译抑制因子发挥作用。最近的研究证明，小RNA广泛参与各种生物学过程，如先天免疫反应、细胞增殖和凋亡、结肠、肺和乳腺癌的发生以及脂质代谢。在我们之前的研究中，我们发现，在隐性白岩（WRR）和兴化鸡（XH）的乳腺肌肉组织中，MiR-34b-5p的表达存在差异。结合这些小RNA序列数据和我们以前的RNA序列数据，我们预测差异表达的基因IGFBP2可能是MiR-34b-5p的靶基因，因此我们推测MiR-34b-5p和IGFBP2可能在肉鸡生长中起到潜在的作用。
MiR-34b-5p是mir-34家族（mir-34a、mir-34b和mir-34c）的成员，可以通过23个核苷酸的成熟序列加工成其前体mirna（mir-34b）。mir-34家族是一个众所周知的癌症抑制因子，它可以被p53诱导并参与许多癌症生物学过程。据报道，在鸡体内，MiR-34b-5p可以通过靶向mda5促进alv-j感染细胞的增殖和alv-j复制。除癌症外，尼罗河罗非鱼骨骼肌发育过程中，MIR-34的表达也存在差异。在小鼠胚胎发育和出生后骨量增加过程中，所有的mir-34家族成员都可能参与并影响成骨细胞分化细胞2019、83602/13。mir-34a还可以促进人肺动脉平滑肌细胞的增殖。此外，mir-34a和mir-34c还可以抑制平滑肌细胞的增殖。据报道，mir-34c在促进分化过程的同时抑制肌肉卫星细胞的增殖。所有这些研究表明，MIR-34不仅可以介导肿瘤的生理过程，而且可以参与肌肉生长的调节。
胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）是IGFBPS（IGFBP1-6）家族的成员。这六种同源蛋白以其与IGF1和IGF2的高亲和力而闻名。IGFBP2作为一种潜在的生物标志物，可以参与多种癌症的研究。以前的研究发现，鸡胚胎期的眼睛、大脑、骨骼肌和心脏中大量表达IGFBP2，在哺乳动物的胚胎组织中高度表达。IGFBP2的DNA多态性与猪的生长、胴体、肉品质和繁殖性状显著相关。然而，除上述研究外，关于IGFBP2在禽类骨骼肌发育中的作用还未见报道。
在本研究中，我们探讨了MiR-34b-5p和IGFBP2在鸡骨骼肌发育中的作用和调节作用。我们证实，MiR-34b-5p可以通过直接抑制IGFBP2的表达来抑制成肌细胞的细胞周期进程，加速肌管的形成。
2.结果
2.1 MiR-34b-5p抑制成肌细胞的细胞周期进展
为了揭示MiR-34b-5p在成肌细胞中的作用，我们将MiR-34b-5p模拟物和抑制剂导入CPM细胞，以评估其对细胞周期进展的影响（图1a）。edu分析发现，MiR-34b-5p的过度表达可能会阻碍CPM细胞的增殖，当我们抑制MiR-34b-5p的表达时，会发现相反的结果（图1b，c）。此外，用MiR-34b-5p模拟物转染后，g0/g1期细胞明显增多，而s期细胞数低于对照组（图1d，f）。用MiR-34b-5p抑制剂转染的细胞周期变化显示相反的趋势（图1e，f）。总之，这些结果表明，MiR-34b-5p可以抑制成肌细胞的细胞周期进程。
图1所示。MiR-34b-5p抑制成肌细胞的细胞周期进展。
2.2 MiR-34b-5p促进肌管的形成
在7周龄兴化鸡的肾脏、胸肌和腿部肌肉中，MIR-34B-5P的表达相对较高（图2a）。将生长介质（GM）改为分化介质（DM），诱导90%左右融合的CPM细胞进行分化，如前所述。GM代表增殖期的成肌细胞，而DM1–DM6代表成功诱导分化为第1天到第6天（在不同时间点）的成肌细胞。结果表明，在分化中期（DM3）和晚期（DM5）时，MiR-34b-5p表达突然增加（图2b）。因此，我们将MiR-34b-5p模拟物转染到CPM细胞中，发现MiR-34b-5p的过度表达显著增加了MYOD（肌源分化）、MYOG（肌生成素）和MYHC（肌球蛋白重链）的表达（在肌生成过程中的三个重要标记基因），而抑制作用则是通过抑制细胞的生长来实现的。f MiR-34b-5p对这些基因有相反的作用（图2e，f）。Western blot分析显示，MiR-34b-5p可以增加MYHC的表达（图2g，h）。此外，MYHC染色结果显示，MiR-34b-5p模拟转染后，肌管的数目和面积大大增加，而MiR-34b-5p的敲除可以抑制肌管的形成（图2c，d）。这些结果表明，MiR-34b-5p促进成肌细胞分化。
图2 MiR-34b-5p促进肌管的形成
2.3 IGFBP2是MiR-34b-5p的直接靶点
IGFBP2的3′utr区的MiR-34b-5p结合位点成功突变（图3A，B）。在df-1细胞中进行的双荧光素酶报告分析显示，与NC组相比，MiR-34b-5p可降低pmirglo-IGFBP2-wt的荧光素酶活性（图3E）。IGFBP2的mRNA和蛋白水平表明，MiR-34b-5p可以直接抑制IGFBP2的表达（图3C，D）。
图3 IGFBP2是MiR-34b-5p的直接靶点。
2.4 IGFBP2促进成肌细胞的细胞周期进展
IGFBP2在7周龄兴化鸡的肾脏、胸肌和腿部肌肉中的表达相对较高（图4A），类似于MiR-34b-5p的表达（见图2A）。通过qrt-pcr和western blot分析，检测了过表达质粒（pcdna3.1-IGFBP2）和si-IGFBP2的效率。这些结果证实了IGFBP2在CPM细胞中成功地过表达和敲除（图4B，C）。EDU分析表明，由于IGFBP2的过度表达，增殖期的细胞数量显著增加，而在IGFBP2敲除后细胞数量减少（图4D，E）。IGFBP2过表达后，g0/g1期细胞数低于对照组，而IGFBP2基因敲除后细胞数呈相反的趋势（图4F-H）。
图4 IGFBP2促进成肌细胞的细胞周期进展。
2.5 IGFBP2是一种抑制肌管形成的药物
qRT-PCR结果表明，IGFBP2在成肌细胞分化过程中可能具有潜在的作用，因为它在成肌细胞分化过程中表现出较高的表达水平，特别是在DM2和DM4处（图5A）。同时，MYOD和MYHC的mRNA表达被IGFBP2过度表达下调（图5B），在IGFBP2抑制后上调（图5C）。MYHC蛋白水平被IGFBP2抑制，并在IGFBP2敲除后上调（图5F，G）。免疫荧光染色显示，IGFBP2的过度表达可能阻碍肌管的形成；相反，IGFBP2的敲除可促进肌管的形成（图5D，E）。这些结果表明，IGFBP2可作为肌管形成的抑制剂。
图5 IGFBP2抑制肌管形成。
3.讨论
成肌细胞增殖、分化和融合成多核肌管，形成肌纤维，肌纤维的形成是骨骼肌发育过程之一，仅发生在胚胎期。除了一些肌肉特异性的小RNA（如mir-206、mir-1和mir-133），许多非肌肉特异性的小RNA也需要分化成肌细胞。这就是为什么我们选择鸡原代成肌细胞来研究MiR-34b-5p和IGFBP2的功能。
据报道，mir-34可以靶向参与细胞周期进程的许多基因，如ccnd1、ccne2、cdk4、cdk6、e2f3、map2k1、map3k9、myc等，我们目前对gga-MiR-34b-5p的研究与hsa-MiR-34b-5p具有相同的结合位点，这意味着gga-MiR-34b-5p可能与hsa-MiR-34b-5p结合。通过这些基因来调节细胞周期的进展。在我们的研究中，我们发现，MiR-34b-5p的过度表达增加了细胞在g0/g1阶段的比例，降低了细胞在s阶段的比例，这表明它可以抑制细胞从g0/g1到s阶段的CPM。
