慢病毒包装Protocol大放送

慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一， 并且正在获得越来越广泛的应用。

在细胞实验中，对于按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过使用病毒介导的方式能够大大提高基因的转导效率，达到目的基因高效表达的目的。

具体来说，慢病毒包装主要应用于以下几个方面：

1、对于难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，极大地方便了RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究；

2、进行稳转细胞株的筛选；

3、为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；

为产生高滴度的病毒颗粒，通常需要利用慢病毒表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。离心收集上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

慢病毒包装实验方法

1. 构建含有目的基因的慢病毒表达载体（GeneCopoeia可提供各种慢病毒载体的ORF、启动子、shRNA、miRNA前体和miRNA抑制剂克隆）
2. 细胞准备：细胞传代后，密度达到70％左右时进行转染；
3. 转染复合物制备：取两个EP管，一个（A管）加入慢病毒载体的表达质粒、混合包装质粒和Opti-MEMI；另一个（B管）加入Opti-MEMI、转染试剂，一边轻柔涡旋A管，一边往A管滴加B管的溶液。溶液混合后，室温放置10-25分钟，即完成转染复合物的制备。
4. 细胞转染：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；
5. 收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

慢病毒包装及检测工具：

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