很火很厉害的iTRAQ定量蛋白质组学技术

 

现在有一种很火的蛋白定量技术叫做iTRAQ,相信很多接触过蛋白组学方面研究的童鞋们都有耳闻,不过可能大多数人对它没有比较深入的了解,现在我们一起来好好了解下这种超厉害的定量蛋白质组学技术。

 

概念         

      

啥是iTRAQ呢?相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术是美国应用生物系统(AB SCIEX)公司与2004年推出的一种全新的体外同重同位素标记的相对与绝对蛋白组定量技术。该同位素标记法利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端和赖氨酸侧链基团,经高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量,能够高通量地寻找不同蛋白质组的差异蛋白并且准确进行相对或绝对定量,是近年来定量蛋白质组学中应用广泛的高通量筛选技术。

 

产生背景

 

随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成,人类跨入了后基因组和蛋白质组时代,以基因组研究成果为基础,各种先进技术为支撑,进一步研究生物有机体的全部蛋白质结构,功能以及相互作用的蛋白质组学是目前的研究热点。蛋白质组学的真正含义在于,在整体,动态,网络的水平上对蛋白质进行定量定性分析,对生命活动进行全面深入的认识。仅仅知道蛋白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论,因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要,一种特殊蛋白质在浓度上的变化,就能预示细胞的突变过程。因此,科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量,是很重要的事情。

 

过去,科学家通常先进行凝较电泳,切断条带,再用质谱方法测量条带中的蛋白质。可是,这种方法既不是非常敏感,也不是非常精确,对我们研究蛋白组有局限性。科学家们一直在探索蛋白组学研究方法。现在,基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法,不需要凝胶,就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。定量蛋白组学是蛋白质组学的一个重要组成部分,即对一套基因组表达的全体蛋白或某一复杂的混合物体系中所有蛋白质进行定量和鉴定。常用的定量蛋白质组学的研究方法有DIGE(difference gel electrophoresis)、iCAT(Isotope-coded affinity tag)、SWATH(Sequential  Windowed  Acquisition  of all  Theoretical  fragment  ions)、SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures)和iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)。iTRAQ技术可实现对多种不同样品中蛋白的比较,具有重现性好、灵敏度高、定性与定量可同时进行的优势,已越来越多的被运用到蛋白组学研究中。

 

iTRAQ试剂

 

iTRAQ实际上是一种同位素标记试剂,可与氨基连接的胺标记同重元素。目前有两种主要使用的iTRAQ试剂:4-plex和8-plex,可同时标记4组或8组样品。

 

下面以4-plex为例来说明iTRAQ试剂标记原理。

 

4-plex

 

iTRAQ包括三部分:报告基团(reporter group ),平衡基团(balance group),肽反应基团(peptide reactive group)。

 

1、报告基团(reporter group):质量分别为114Da、115Da、116Da、117Da。

 

2、平衡基团(balance group):质量分别为31Da、30Da、29Da、28Da,使得四种iTRAQ试剂报告基团和平衡分子的总分子量均为145Da,无论使用哪种iTRAQ试剂,不同同位素标记同一肽段后在一级质谱中,分子量完全相同,呈现的都是同一峰值。

 

3、肽反应基团(peptide reactive group):将reporter group与肽N端及赖氨酸侧链连接,从而将报告基团和平衡基团标记到肽段上,几乎可以标记样本中所有蛋白质。

 

而8-plex的报告基团共有八种,质量分数分别为114-121Da(图2b),因此iTRAQ最多可同时标记8组样品。

 

iTRAQ(a)4-plex和(b)8-plex的化学结构iTRAQ(a)4-plex和(b)8-plex的化学结构

 

工作流程和原理:

 

iTRAQ(8-plex)流程图iTRAQ(8-plex)流程图

 

1、 分别水解蛋白样品,得到肽段的混合物。

 

2、用iTRAQ对蛋白样品进行标记,使不同iTRAQ试剂标记样品中的所有肽,并混合所有标记后的蛋白样品(图3b)。

 

3、对混合标记后的蛋白样品进行串联质谱,得到一级质谱图。在一级质谱图中,因为无论使用哪种iTRAQ试剂,不同同位素标记同一肽段后分子量完全相同,所以不同来源的同一蛋白同一标记肽段在一级质谱图中呈现为一个。

 

一级质谱图(iTRAQ鉴定)

一级质谱图(iTRAQ鉴定)

 

4, 收集一级质谱图中同一个峰的样品,得到不同样品的相同肽端混合物。如收集到图4黄色标记处的蛋白样品,对加入标记的肽段进行二级质谱,得到二级质谱图。

 

二级质谱图( iTRAQ定量)二级质谱图( iTRAQ定量)

 

此时报告基团、平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,平衡基团丢失,带不同同位素标记的同一多肽产生质量为113,114,115,116,117,118,119和121Da的报告离子(8-plex),报告离子呈现出不同的峰,将波峰的高度面积等相关数据经过软件处理,结合数据库对比分析,可获得不同样品间相同肽段的定量信息。

 

技术优势

 

适用范围广:iTRAQ可检测到的蛋白除了胞浆蛋白外,还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。也能对任何类型的蛋白质进行鉴定,包括高分子量,酸性,碱性蛋白质。

 

高通量:一次最多可以实现8个样品的定性定量分析,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。

 

结果可靠:基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法,定性与定量同步进行,同时得出鉴定和定量结果,重复样品间的蛋白表达量相关性高。

 

灵敏度高:分级分离,降低样品复杂度,相比凝胶电泳观测到的蛋白变化在2倍以上,iTRAQ计算出的蛋白变化在1.3-1.6倍之间,可检测低丰度蛋白。

 

高效:定性定量同步进行,且有较高重复性。

 

自动化程度高:液质连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好

 

应用前景

 

目前,iTRAQ已被广泛地应用于植物,微生物,动物,环境等多种样本的蛋白质鉴定和定量。其已成功应用到医学研究领域,能够分析鉴定出肿瘤组织的差异性蛋白,从而找到正常组织癌变的标志物;也可以筛选出与药物作用的差异性蛋白,进而研究药物作用靶点和机制;iTRAQ技术还可以为我们研究疾病的发生、进展机制,发现新的生物学标记物提供有力的技术平台。iTRAQ技术与蛋白组学完美结合,将在医学,农业,工业得到更大发展。

 

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