小师妹：师兄师兄，快粗来
大师兄：师妹有求必应，什么事呀，小师妹
小师妹：我做的NeuN做的IF荧光模糊不清，是二抗的原因吗？
小师妹：
大师兄：NeuN是成熟细胞核抗原，主打细胞核定位。荧光模糊的原因有很多，从结果来看抗体的原因原因可以排除。
小师妹：我们一般实验不成功都会认为是抗体的原因的，这次为什么不是抗体的原因呢？
大师兄：那是肯定的啦！容我给你慢慢道来。
每一张免疫荧光的图片都是一份艺术作品，如果是实验免疫组化的资深选手，信手一拍，出来的就是这样的图片：
www.fansbio.com/content/?400.html
www.dxy.cn/bbs/thread/38628725?sf=2&dn=5#38628725
www.biofavor.cn/index-show-tid-200.html
www.rolesbio.com/product/5069.html
各种组织形态、细胞结构、蛋白形状，错落有致，有机结合，组成一个绚丽多姿，精美绝伦的荧光世界，揭开一个又一个的科研奥秘。真的是美到令人窒（ji）息（du）。
那么，究竟要如何操作，才能像资深选手一样，获得一系列完美的免疫荧光结果呢？
今天，我带大家来深入了解一下免疫荧光实验~
实验原理：
免疫荧光(immunofluorescence technic)：Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。
操作步骤：
一、样本处理
※细胞爬片
1.在细胞培养孔板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5
2.在4%多聚甲醛或其他固定液常温固定15min, PBST洗三次,每次5min(固定方法不唯一,具体根据细胞总类而定)。
※冰冻切片
1.固定组织冰冻切片室温平衡复温30min；
2.PBST洗三次,每次5min；
※石蜡切片
1.脱蜡水合
a.在二甲苯Ⅰ号缸中浸泡15min；
b.在二甲苯Ⅱ号缸中浸泡15min；
c.在无水乙醇Ⅰ号缸中浸泡5min；b
d.在无水乙醇Ⅱ号缸中浸泡5min；
e.在95%乙醇中浸泡5min；
f.在80%乙醇中浸泡5min；
g.在60%乙醇中浸泡5min；
h.用去离子水洗涤3遍，每遍5min。
此处 I 号和 II 号缸是指不同的容器，但是内容物一致。
2.抗原修复
取适量的柠檬酸钠修复液(pH 6.0)或Tris-EDTA修复液(pH 9.0)于玻璃烧杯中(修复液能没过切片架即可),待修复液煮沸后,将切片放入其中,盖上盖子,继续煮沸修复液15min。通风厨中自然冷却。
- PBST浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBST，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
- 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，常温下孵育2-3h（或者四度孵育过夜）；二抗常温孵育1h或4℃过夜。注意：从加荧光一抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
- 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；4. 用吸水纸吸干玻片上多余的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
疑难解析FAQ
- 免疫荧光切片显微镜拍到形状不规则的亮点应该如何处理？
不规则且较多的亮点一般是因为玻片材质存在杂质或者是表面的灰尘，可以通过调整焦面到组织上来就可以避免。
2.拍照过程中，通道切换的方法是怎样的？
先在白光下找到目标位置，并调到最清晰的焦距，再切换到荧光通道进行拍摄。
3. 如何避免染料褪色？
为了降低某些样品的褪色程度，建议在光照到达激发滤光器之前在光路中使用中性密度滤光片，从而减小激发光强度。在其他情况下，可以通过改变封固剂的pH或通过使用抗漂白剂来减少褪色效果（表2中列出了几种更重要的试剂）。对于数字成像，显微照相或简单的视觉观察，快速改变视野也可以避免褪色效应。
- 拍照过程中组织局部清晰，其它区域模糊是什么原因？
制作组织切片过程中，有局部区域在玻片上粘贴不牢固，有脱片倾向，导致样本不在一个焦面上，显微镜下呈现出模糊的影像。
- 组织细胞无着色
一种情况是实验操作问题，包括实验操作方法不准确、实验材料不新鲜、抗体种属和反应性选择和抗体质量问题等，这些均可通过设置阳性对照以及阴性对照实验来排除。第二种情况是蛋白表达问题，同上期讲的“WB实验无条带”一样，IF实验准备阶段也需要查阅大量资料，初步确认目的蛋白的时空表达谱（包含表达量、表达部位、刺激条件等）。
