杂交瘤细胞筛选——HAT培养基来帮忙

 

1964年Littlefield首先发明了HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤,A-Aminopterin氨基蝶呤,T--Thymidine 胸腺嘧啶核苷)培养基的选择培养。

 

HAT培养基是指含有次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质的细胞培养基,说起HAT培养基,我们可能会想到这是用于杂交瘤细胞筛选的常用培养基。是的,首先给大家介绍一下细胞内DNA原料核苷酸的两种主要合成途径:

 

(1)主要合成途径:生物体内嘌呤核苷酸合成,首先由5-磷酸核糖焦磷酸合成次黄嘌呤核苷酸,次黄嘌呤核苷酸合成后,经氨基化即可形成腺嘌呤核苷酸;经氧化和氨基化即可形成鸟嘌呤核苷酸。再来看嘧啶核苷酸的合成,生物体内先先由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成尿嘧啶核苷酸,然后尿嘧啶核苷酸经磷酸化、氨基化就可形成胞嘧啶核苷三磷酸;在核糖核酸还原酶的还原作用下可形成尿嘧啶脱氧核糖核苷酸,再经过甲基化后可形成胸腺嘧啶核苷酸。

 

(2)旁路合成途径:利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。

 

核酸合成主要途径

 

既然体内有两条核酸合成途径,那么我们是否可以抑制其中一条途径然后利用另一条来进行筛选呢?科学先驱们想出了如下方法利用核酸的合成途径来制备杂交瘤细胞生产单克隆抗体:

 

将B细胞于肿瘤细胞进行融合培养后,在一款选择培养基中添加某些物质来阻断核酸的主要合成途径,那么未融合的瘤细胞和自身融合的瘤细胞在筛选过程中就会死去,能存活下来的就只有能进行旁路途径合成核酸的B细胞和瘤细胞的融合细胞了

 

核酸合成主要途径

 

根据这一设想,科学家们开发了HAT选择性培养基,其中H代表次黄嘌呤,A代表氨基蝶呤,T代表胸腺嘧啶核苷酸。

 

HAT选择培养基筛选原理

A—氨基蝶呤为叶酸的结构类似物,正是它阻断了核酸合成的主要途径,阻碍了次黄嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成。H—次黄嘌呤,可经核酸合成旁路途径合成次黄嘌呤核苷酸,从而完成嘌呤核苷酸的补救合成。T—胸腺嘧啶核苷酸,直接添加到培养基中来补足被阻断的嘧啶核苷酸的合成。

 

HAT选择培养基筛选原理

 

HAT培养基是指将上述三种物质按照一定的配比合成的细胞培养基。再细胞合成DNA原理——各类核苷酸的时候,氨基蝶呤可阻碍主要合成途径,所以培养基中含有它时,细胞便只能通过旁路合成途径合成核苷酸或者额外供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞,由于失去增殖能力逐渐死亡。根据这一点,不仅把混存于细胞群中的正常细胞,通过试管内培养进行选择,例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株,由于可以互补,所以两者的融合细胞,即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下,利用HAT培养基可对融合细胞进行筛选,次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料添加到培养基中。

 

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