钙可作为多种细胞中的通用第二信使，Ca 2+调节所有类型细胞的许多功能，因此钙测量对于各种生物学研究至关重要。在1980年代，Tsien及其同事生产了各种荧光指示剂。其中Indo-1，Fura-2，Fluo-3和Rhod-2是测量Ca 2+浓度的最有价值的染料。近年来，荧光探针领域引领者AAT陆续推出了更优秀的钙离子探针：Fluo-8 ®，Cal-520 ® 和Calbryte™520，这些为实现高通量监测钙浓度，筛选GPCR和钙离子通道药物筛选提供了有力的工具。
然而，面对市面上五花八门的钙离子探针，我们该如何选择呢，别慌，小艾之前撰写的这两篇文章可以带给大家一些帮助：
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本期我们总结了几个关于钙离子探针的常见问题，都是平时大家经常咨询的，相信大家或多或少也遇到过相关的问题，今天做了一个汇总希望能给大家带来一些帮助：
1.检测内质网（ER），线粒体内的钙离子浓度变化，该使用哪款探针呢？
线粒体钙离子检测：Rhod-2（21060），Rhod-2，是罗丹明123（Rhodamine 123）的衍生产物，一种与钙离子结合产生荧光，同时由于其正电荷特性，会特异性聚集在线粒体里，由此用于测定线粒体内钙离子水平。在荧光酶标仪下，激发波长550nm，发射波长 590nm，可用来定量测定线粒体中的钙浓度。
内质网钙离子检测： Cal-520N（Cat# 21146）, Calbryte 520L（Cat# 20640）, Fluo-5N（Cat# 20566）和Mag-fluo4（Cat# 20401)；
关于内质网内钙离子标记可参考下方文献：https://www.researchgate.net/profile/Alexei-Verkhratsky/publication/226512100_Ca2_Imaging_of_Intracellular_Organelles_Endoplasmic_Reticulum/links/0c96052961398ab829000000/Ca2-Imaging-of-Intracellular-Organelles-Endoplasmic-Reticulum.pdf?_sg%5B0%5D=ndp33K01GY0Unl4pu9_TSJkuSDdL55Obb4-jEU06s-fq6J5aJm_dumpO6B8Xta2_AVR3qrQb36uvh1o1W33oLw.Hcd0tb6mWOMf1r1IRgUPhX4UXQ3yrDvIrS7me5OmCKZvqeETZDUw9rdphS2VGXyE8BQABDg9nIk9f5LBzz85BA&_sg%5B1%5D=6TIcuLp1b5w6714FjVuu8A4uWU3oS8FEzEO3aQ1EDrgNH4H8-qeE7nQaAhBre9HUhSX8HyyX2KPGjFQYcmoID0z7-ELSUpYyUQZMXkFnzsQ7.Hcd0tb6mWOMf1r1IRgUPhX4UXQ3yrDvIrS7me5OmCKZvqeETZDUw9rdphS2VGXyE8BQABDg9nIk9f5LBzz85BA&_iepl=
2.检测细胞中钙离子时加入丙磺舒（probenecid）的作用是什么？文献报导丙磺舒（probenecid）可能会干扰钙离子通道，比如干扰环核苷酸门控通道，有没有可以不用丙磺舒的钙离子探针？
丙磺舒（probenecid），是一种阳离子转运体抑制剂，用来降低探针进入胞内后被排除的几率，以提高胞内信号。常见的Fluo-3 、fluo-4、 Fluo-8都需要加丙磺舒，否则信号会很低。您可以选择Calbryte系列，该系列无需丙磺舒（probenecid）仍会有很好的信号。
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图示：存在丙磺舒（左）和不存在（右）的情况下进行Ca2+检测测定，并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3测量了截止波长为570 nm的响应。
图示：加或者不加丙磺舒（probenecid）对Fluo-4和Calbryte 520荧光标记结果的影响
3.荧光探针的AM、盐形式、Dextran葡聚糖形式有什么区别？
AM酯形式：AM酯形式是一种可以透过细胞膜进入细胞的，不需要其他辅助工具；
盐形式：盐形式的Fluo-8不能自行穿过细胞膜，需要辅助进入细胞，如微量注射等；
Dextran葡聚糖形式：若检测孵育时间久容易发生区室化，比如钻进了内质网等亚器官内，Dextran最大的优势就是降低了区室化作用，但是需要显微注射或其他方式才能进入细胞内。
4.有定量检测样本中钙离子的试剂盒吗？
人体血液里钙离子的浓度大约在19 -10.5 mg/dL范围内，血液里钙离子浓度过低或者过高可引起低钙血症和高钙血症。Amplite 荧光法钙离子定量试剂盒（Cat#36360）可用于定量体液的钙离子浓度，可使用96孔或者384孔板经酶标仪读取数值， 不需进行样本分离直接检测，30min可完成，最低检测到0.03mM的钙离子。
5.有能用于植物细胞（拟南芥原生质体）的钙离子探针吗？
常用的 Fluo-4 AM, Fluo-8 AM 以及 Calbryte 520 AM, 都适用于植物细胞，Fluo-4最常用，若要获得更好的信噪比，推荐其升级版本 Calbryte 520 AM。
参考文献：
https://www.nature.com/articles/s41438-020-0315-3
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3975371/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2923527/
6.常见的几款绿色的钙离子探针各有哪些优缺点？
几款常见绿色钙离子荧光探针性能比较：
| 产品名称 | Ex/Em(nm) | (信号背景比)S/B | 相对亮度 | 细胞内 保留 |
加载时间 | 其他 |
| Fluo-3 | 506/526 | 2 | 50 | 相比最低 | 1 h | 在相同条件下，Calbryte探针的亮度明显更高 |
| Fluo-4 | 494/516 | 4.5 | 100 | 低 | 1 h | |
| Fluo-8 | 490/514 | 4.5 | ~200 | 低 | 0.5-1 h | |
| Cal-520 | 492/514 | 9.0 | ~150 | 高 | 1-2 h | |
| Calbryte-520 | 490/514 | 10.0 | ~350 | 高 | 0.5-1 h |
几款绿色荧光探针的荧光亮度对比：
7.单波长探针与比值型探针的区别有哪些？
| 绿色 荧光探针 |
红色 荧光探针 |
深红色 荧光探针 |
比率荧光探针（确定绝对和相对Ca2+浓度） | 钙离子 免洗产品 |
| Fluo-3 Fluo-4 Fluo-8 Cal-520 Calbryte 520 |
Rhod-2 Rhod-4 Cal-590 Calbryte 590 |
Cal-630 Calbryte 630 |
Fura-2 Fura-8 Fura-10 (NEW) Indo-1 Cal Red R525/650 |
Fluo-4（免洗）: 36325 Fluo-8（免洗）: 36315 Calbryte 520（免洗、免丙磺舒）：36318 Fura-2（免洗）：36320 Rhod-4（免洗）: 36334 Calbryte 590（免洗、免丙磺舒）: 36201 |
单波长与比率法的优缺点对比：
| 单波长 | 比值型 |
| 1.在静息钙水平下背景荧光最小 2.良好的信噪比 3.大大提高了细胞内保留 4.覆盖光谱：紫外线（UV），紫色和可见光激发 5.不同的亲和力（低、中、高）提供的敏感度满足于各种应用 |
1.准确测量细胞内钙浓度 2.将染料负载不均匀、染料泄漏、光漂白和细胞厚度变化（常见于混合群体）的影响降至最低 3.提供更可靠和可重复的结果 4.指示剂拥有双激发/发射光线 |
常见钙离子探针推荐：
| 颜色 | 名称 | 货号 |
| 绿色荧光 | Fluo-3 | 21010 |
| Fluo-4 | 20550 | |
| Fluo-8 | 21080 | |
| Cal-520 | 21130 | |
| Calbryte 520(不需要丙磺舒) | 20650 | |
| 红色荧光 | Rhod-2 | 21060 |
| Rhod-4 | 21120 | |
| Cal-590 | 20510 | |
| Calbryte 590(不需要丙磺舒) | 20700 | |
| 深红色荧光 | Cal-630 | 20530 |
| Calbryte 630(不需要丙磺舒) | 20720 |
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文章来源：钙离子荧光探针常见问题大盘点
