流式细胞仪数据采集与分析

摘要

通过上周对流式细胞仪原理的了解，童靴们可以更好的掌握实验，今天接着干货分享如何快速对流式细胞仪数据采集与分析，以便更准确的得出结论。

一、数据采集及显示

将前向散射光检测器、侧向散射光检测器及荧光检测器收集的光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。

数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道，纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图1）。处在同一通道的每一细胞符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。三维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图1）。

图1 流式数据分析图

二、设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域（如图2）。如，血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。

图2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

三、细胞亚群的数据分析

门内细胞亚群的数据结果可在随后的图中显示。我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。

直方图可直观的显示单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（如图3）。

图3 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰（NORM002）

图4 直方图统计结果

图4的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞为619个，M2（CD3阳性）细胞为2272个。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为，M2：Gated = 2272/2891 = 78.59%

二维散点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5左图为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，将全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞及双阳性细胞。左下象限（Lower left，LL）为双阴性细胞，左上象限（Upper left，UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），右下象限（Lower right，LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（Upper right，UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。

图5 阴性对照组（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE双染样本（NORM002）

图6 二维散点图统计结果

如图6所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839 = 10.43%

除了划定象限，分析细胞亚群散点图的另一个方法是划定区域，也就是设门，即在门中在设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图7）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图8中，R4门内为CD4+，CD3-的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866 = 1.40%

图7 CD3 FITC/CD4 PE双染样本分析图

图8 CD3 FITC/CD4 PE双染样本数据统计结果

这种门内设门的方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。为避免这种情况的发生，可以采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。该方法的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（如图9）。

图9 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化比较

四、流式细胞仪的其他数据分析

上面提到的这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。如图10所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。