摘要:
背景:幽门螺杆菌(HP)中的脂多糖(LPS)在胃癌的发生和发展中起着重要作用。Toll样受体4(TLR4)和髓系分化蛋白2(MD-2)也被报道参与胃癌细胞的增殖和侵袭。CXC趋化因子受体7(CXCR7)是CXCL12的第二个受体,已在多种肿瘤组织中被检测到。然而,对CXCR7的生物学功能和调控及其与胃癌中TLR4和MD-2的关系尚不完全了解,因此需要进一步研究。
方法:采用免疫组化方法检测150例胃癌组织中CXCR7的表达。采用RT-PCR和Western blotting检测了几种胃癌细胞系(SGC7901、AGS、MGC-803、MKN-45和BGC823)中CXCR7的表达。shrnas是用pgpu6/gfp/neo载体设计的。用CCK-8法检测细胞增殖,用穿孔法检测细胞迁移。此外,还建立了胃癌异种移植模型。
结果:LPS-TLR4-MD-2途径可提高SGC7901细胞中CXCR7的表达,TLR4/MD-2介导的CXCR7水平的升高可调节肿瘤细胞的增殖和迁移。TLR4和MD-2的敲除证明两者对脂多糖诱导的CXCR7表达都是必要的,后者反过来又负责脂多糖诱导的SGC7901细胞增殖和迁移。此外,在胃癌组织中,TLR4、MD-2和CXCR7的表达高于癌旁的正常对照组织。TLR4、MD-2和CXCR7的表达水平与胃癌TNM分期和淋巴结转移密切相关。在动物模型中,对照组和实验组在肿瘤肿块中的CXCR7表达有显著差异。
结论:本研究结果表明,CXCR7通过炎症机制在胃癌进展中发挥重要作用,提示CXCR7可为胃癌靶向药物的开发和临床应用提供依据。
背景
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球癌症死亡率的第三大主要原因。慢性炎症与许多恶性肿瘤相关,与正常人群相比,慢性萎缩性胃炎伴有肠化生与胃癌发病率增加相关。幽门螺杆菌(HP)被世界卫生组织认为是胃癌发病机制中的主要致癌物。因此,HP引起的慢性炎症在胃癌的发生和发展中起着重要作用。脂多糖(lps)是HP细胞真皮最外层的有毒成分,可能导致胃粘膜长期炎症损伤。
跨膜toll样受体(tlrs)是一类信号转导蛋白,被称为模式识别受体,能特异识别病原体相关分子模式(pamps)。TLR4最初被发现是一种人类TLR,由革兰氏阴性细菌的LPS致敏。相关研究发现,TLR4在胃癌组织中表达上调,在正常胃粘膜中表达较低。脂多糖可通过与TLR4和髓系差异蛋白2(MD-2)复合,诱导形成脂多糖-TLR4-MD-2多聚体,从而进一步激活促炎信号通路,促进相应细胞因子和受体的表达。因此,应研究TLR4在胃癌进展中的致病机制。CXC趋化因子受体7(CXCR7)是CXCL12的第二个受体,已在多种肿瘤组织的表面检测到。然而,CXCR7的生物学功能和调控及其与胃癌TLR4和MD-2的关系尚不完全清楚,值得研究。
本研究探讨了CXCR7在胃癌LPS/TLR4/MD-2调控通路中的作用。LPS暴露可增加胃癌SGC7901细胞中CXCR7的表达,其高度表达TLR4/MD-2。此外,LPS刺激通过TLR4/MD-2信号诱导胃癌中CXCR7的表达,促进SGC7901细胞的增殖和迁移。此外,用荷瘤裸鼠和临床病理学证实了lps/tlr4/cxcr7通路可能是胃癌发展的关键。这些结果表明,炎症与胃癌之间的联系可能有助于开发新的抑制肿瘤发生和发展的方法。
结果
图1 TLR4和MD-2在胃癌细胞中的表达。采用RT-PCR (a)、qRT-PCR (b, c)和western blotting (d)检测胃癌细胞株TLR4和MD-2的表达
TLR4、MD-2、CXCR7在胃癌细胞中的表达
我们用RT-PCR和Western blotting研究了人胃癌细胞系(SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823和MKN-45)和正常胃上皮GES-1细胞中TLR4和MD-2的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,在胃癌细胞系中,TLR4和MD-2的mRNA和蛋白表达高于正常的胃上皮GES-1细胞(图1a-d)。在SGC-7901细胞系中观察到TLR4和MD-2的最高表达水平。此外,我们在上述细胞系中检测到CXCR7的表达,并发现CXCR7的表达普遍较低。相比之下,SGC7901细胞中的CXCR7表达水平稍高,而这些细胞中的CXCR4表达水平相对较高。因此,选择SGC7901细胞系研究TLR4/MD-2信号通路。
LPS上调CXCR7表达,促进SGC7901细胞增殖和迁移
我们用LPS处理SGC7901细胞,观察其对CXCR7增殖和迁移的影响。当用不同浓度的LPS刺激SGC7901细胞时,CXCR7的表达以浓度依赖性的方式增加到500ng/ml(图2a)。当细胞用500ng/ml的lps处理12、24和48h时,CXCR7的表达以时间依赖性的方式增加到24h(图2b)。与脂多糖诱导的SGC7901细胞中CXCR7表达的变化相比,脂多糖诱导的CXCR4表达没有明显增加(图2c)。接下来,我们使用CCX771(一种新的CXCR7特异性拮抗剂)和CXCL12(一种内源性CXCR7配体)通过CCK8和Transwell分析来检测CXCR7在调节SGC7901细胞增殖和迁移中的作用。由于CXCR4是CXCL12的另一个受体,在一些实验中,SGC7901细胞被AMD3100(一种CXCR4拮抗剂)预处理。在CXCL12刺激和LPS孵育后,我们发现SGC7901细胞在48小时后表现出明显的增殖和迁移。在用CCX771或AMD3100预处理SGC7901细胞后,在有CXCL12存在的情况下,增殖和迁移刺激作用降低。然而,CXCR7比CXCR4更能促进增殖和迁移(图2d-e)。
图2 LPS诱导SGC7901细胞CXCR7表达变化
通过敲除TLR4和MD-2, lps诱导的CXCR7表达被阻断
接下来我们研究了LPS诱导的CXCR7表达是否通过TLR4/MD-2途径促进SGC7901细胞增殖和迁移。用靶向TLR4和MD-2的特异性shrnas转染SGC7901细胞。当内源性TLR4和MD-2被shrna击倒时(图3a-c),LPS诱导的SGC7901细胞增殖和迁移比错乱和阴性对照组下降(图3d-e)。此外,用抗TLR4和抗MD-2 shrna转染的SGC7901细胞与LPS共体积后,CXCR7的mRNA和蛋白表达水平没有增加。与对照组相比,用抗TLR4和抗MD-2 shrnas转染的SGC7901细胞中CXCR7的表达明显降低(图3f-g)。总的来说,这些结果表明,TLR4/MD-2信号通路对于脂多糖诱导的CXCR7表达增加及其促进SGC7901细胞增殖和迁移是必不可少的。
图3 TLR4和MD-2敲低对lps诱导的CXCR7表达的影响
结论
总之,lps/tlr4途径与胃癌的发展有关,tlr4、md-2和cxcr7之间的相互作用与肿瘤的生长和转移密切相关。了解微生物信号与胃癌之间的关系可能对肿瘤的预防和治疗产生重大影响。