比色法的原理和发展历程

比色法(colorimetry)是生化检测中很常用的方法,以生成有色化合物的显色反应为基础,通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量。早在公元初古希腊人就曾用五倍子溶液测定醋中的铁。1795年,俄国人也用五倍子的酒精溶液测定矿泉水中的铁。但是,比色法作为一种定量分析的方法,大约开始于19世纪30~40年代。

 

 

比色法的原理

 

比色法的理论依据是物质的颜色与光的关系,光是一种电磁波,自然是由不同波长(400~700nm)的电磁波按一定比例组成的}昆合光,通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。如把两种光以适当比例混合而产生白光感觉时,则这两种光的颜色互为补色。当白光通过溶液时,如果溶液对各种波长的光都不吸收,溶液就没有颜色。如果溶液吸收了其中一部分波长的光,则溶液就呈现透过溶液后剩余部分光的颜色。例如,我们看到KMnO4溶液在白光下呈紫色,就是因为白光透过溶液时,绿色光大部分被吸收,而紫色光透过溶液。同理,CuSO4溶液能吸收黄色光,所以溶液呈蓝色。由此可见,有色溶液的颜色是被吸收光颜色的补色。吸收越多,则补色的颜色越深。比较溶液颜色的深度,实质上就是比较溶液对它所吸收光的吸收程度。

朗伯-比尔定律(Beer-Lambert Law),又称比尔定律、比耳定律、布格-朗伯-比尔定律,是光吸收的基本定律,适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质,包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目 。

物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比,而透光度T与c、b成反比。

比尔-朗伯定律数学表达式

A=lg(1/T)=Kbc

A为吸光度,T为透射比(透光度),是出射光强度(I)比入射光强度(I0).

K为摩尔吸收系数.它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关.

c为吸光物质的浓度,b为吸收层厚度.【b也常用L替换,含义一致】

 

比色法的分类

常用的比色法有两种:目视比色法和光电比色法。

 

1.目视比色法

常用的目视比色法是标准系列法,该法采用一组由质料完全相同的玻璃制成的直径相等、体积相同的比色管,按顺序加入不同量的待测组分标准溶液,再分别加入等量的显色剂及其他辅助试剂,然后稀释至一定体积,使之成为颜色逐渐递变的标准色阶。再取一定量的待测组分溶液于一支比色管中,用同样方法显色,再稀释至相同体积,将此样品显色溶液与标准色阶的各比色管进行比较,找出颜色深度最接近于样品显色溶液的那支标准比色管,如果样品溶液的颜色介于两支相邻标准比色管颜色之间,则样品溶液浓度应为两标准比色管溶液浓度的平均值。标准系列法的主要优点是设备简单和操作简便,但眼睛观察存在主观误差,准确度较低。

 

  1. 光电比色法

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度,将吸光度对浓度作图,绘制工作曲线,然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。光电比色计通常由光源(钨灯)、滤光片、吸收池、接收器(光电池或光电管)、检流计五部分组成。光路结构上有单光电池式和双光电池式两种:单光电池式仪器的测量结果受光源强度变化影响较大,而双光电池式仪器则避免了这种影响。与目视比色法相比,光电比色法消除了主观误差,提高了测量准确度,而且可以通过选择滤光片和参比溶液来消除干扰,从而提高了选择性。光电比色计和紫外-可见分光光度计的光路结构非常相似,它们之间所不同的地方在于:①分光光度计采用棱镜或光栅作色散元件,因而可以得到纯度较高的单色光束。而光电比色计采用滤光片,只能得到一定波长范围的光谱带(复合光);②紫外-可见分光光度计采用紫外和可见区的光源,即氢灯和钨灯,而光电比色计只用一种钨灯光源,因而前者适用于紫外-可见光谱区,而后者只适用于可见光谱区;③紫外-可见分光光度计可以测定待测组分的精细吸收光谱,不仅可用于定量分析,而且可以作有机化合物的定性和结构分析,而光电比色计只能作定量分析。此外,分光光度计一般都采用灵敏度高的光电倍增管作检测器,而光电比色计一般用光电池或光电管作检测器。因此,光电比色计无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。

 

比色法的发展历程

 

在20世纪30~60年代,是比色分析发展的繁盛时期,它广泛用于冶金、地质、金属材料中微量的金属和部分非金属元素的测定。随着光学仪器制造技术的发展,紫外-可见分光光度计应用日益普及,而酶标仪的出现使得比色法得到了更广泛的应用。酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计。目前较常用的比色法是微量比色法,即用96孔板替代比色杯,酶标仪替代分光光度计,操作简便,结果的准确性,稳定性和可重复性也更好。

比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的,一般包括两个步骤:首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应,形成有色化合物,然后再比较或测量有色化合物的颜色深度。比色分析对显色反应的基本要求是:

①反应应具有较高的选择性,即选用的显色剂最好只与待测组分反应,而不与其他干扰组分反应或其他组分的干扰很小;

②反应生成的有色化合物有恒定的组分和较高的稳定性;

③反应生成的有色化合物有足够的灵敏度,摩尔吸光系数一般应在104以上;

④反应生成的有色化合物与显色剂之间的颜色差别较大,它们的最大吸收浓度之差一般应在60纳米以上。选用的显色剂可以是一种试剂,也可以是两种不同的试剂。如果待测组分与两种不同的试剂反应生成一种有色化合物,则称为三元络合物显色反应。这类显色反应常常具有更高的灵敏度和选择性,在比色法和紫外-可见分光光度法中应用非常普遍。选择适当的显色反应,研究最合适的反应条件和消除干扰的方法是比色分析的关键问题。溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响。

 

在以后的文章中,我们会给大家介绍一些常见的显色试剂,敬请期待!

 

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