高分辨率熔解曲线(HRM)分析预混Mix(PCR),用于基因筛查?

 

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PCR试剂盒

 

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,具有极高的敏感性,可以检测出单个碱基的差异。

 

作为一种高效稳健的"post-PCR"技术,它不受突变碱基位置与类型的限制,无需序列特异性探针,在PCR结束后直接运行高分辨熔解即可完成对样品的分析。HRM技术因操作简便快捷、成本低廉、结果准确,并且实现了真正的闭管操作而受到普遍关注。

 

HRM原理:

 

在PCR反应前将新型DNA饱和荧光染料加入反应体系,然后将PCR产物直接导入高分辨熔解分析仪中,在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行加热变性,仪器的光学检测系统采集、分析荧光信号并绘制温度熔解曲线,根据不同熔解曲线形状来区分(单个)碱基差异。

 

最广泛的 HRM 分析应用领域是基因筛查。基因筛查是搜索 PCR 扩增片段中是否存在未知变异,它可在测序步骤之前进行或者作为替代测序方法。由于 PCR 产物突变可导致 DNA 熔解曲线的形状改变,因此它可以利用 HRM分析检测。杂交双链 DNA 样本扩增并熔解时,其熔解曲线不同于纯合野生型或突变样本。如果操作得当,可以减少至少95%的测序工作量。随着DNA染料和分析仪器的发展,HRM技术还将继续完善和改进,在遗传病分子诊断领域发挥更多的作用。

 

HRM应用:

 

• 基因筛查 (突变研究) • 杂合性研究
• 突变分析 • 物种鉴定
• 单核苷酸多态性 (SNP) 检测 • 甲基化分析

 

高分辨熔解曲线分析技术(HRM) 疑问与解答

 

作为专注于PCR领域超过24年的高品质试剂供应商,Solis BioDyne为您推荐,5X热启动EvaGreen高分辨率熔解曲线分析-预混Mix(PCR):

 

名称 货号 兼容的PCR仪器
5x HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix (NO ROX) 08-31-00001 Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™
Qiagen: Rotor-Gene® 6000
Eppendorf: Mastercycler®: ep realplex2 & ep realplex4
Illumina: The Eco™
Roche: LightCycler® 480

* 不含参比染料ROX,如需要含ROX,请选择:08-33-00001

 

5X热启动EvaGreen高分辨率熔解曲线分析-预混Mix(PCR)提供如下组分:

 

  • HOT FIREPol®DNA Polymerase
  • 5x EvaGreen®HRM buffer
  • 12.5 mM MgCl2 = 1x PCR solution – 2.5 mM MgCl2
  • dNTPs
  • EvaGreen®dye
  • BSA

(客户仅需准备水,模板DNA,引物即可)

 

极高的性价比(进口品质,国产价格):

 

品牌 货号 规格 目录价(元) 单次反应价格(元)
Solis BioDyne 08-31-00001 1ml(250次) 386 1.54
Thermo 4415452 5*5ml(2500次) 18856 7.54
Qiagen 206546 25ml(2000次) 21810 10.9
DBI DBI-2232 1000次 11000 11
天根(Tiangen) FP210-02 500次 2480 4.96
宇恒生物(UE) S2013 500次 2300 4.6

 

推荐的qPCR反应体系配置:

 

组分 体积 终浓度
5x HOT FIREPol® EvaGreen® HRM Mix 4 µl 1x
正向引物 (10 pmol/µl) 0.16-0.5 µl 80-250 nM
反向引物 (10 pmol/µl) 0.16-0.5 µl 80-250 nM
DNA模板 可变 可变
H2O(PCR级) up to 20 µl
Total 20 µl

 

* DNA模板浓度:cDNA 0.1 pg/μl -10 ng/μl ; gDNA 10 pg/μl – 4 ng/μl

 

推荐的qPCR反应程序:

 

循环步骤 温度 时间 循环数
起始激活(热启动) 95ºC 12 min 1
变性  95ºC 15 s 40
退火 60º-65ºC 20 s
延伸 72ºC 20 s

 

发表文章实验结果展示:

 

【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?” European Journal of Human Genetics 26 (2018): 1708-1712.

 

Solis试剂盒

使用Solis试剂盒,分析PAX2基因4号外显子的错义突变

 

【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.” Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.

 

CDKAL1基因

使用Solis试剂盒,分析CDKAL1基因SNP

 

HRM分析成功的关键:

 

1.保持较短的扩增片段,实现最高的灵敏度。与较大的扩增片段相比,100 bp 左右的扩增片段可简化单核苷酸熔解曲线的检测。

 

2.确保 PCR 扩增片段的特异性。错配产物和引物二聚体可使数据解释复杂化。引物浓度低于 200nM,MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范围及使用热启动DNA 聚合酶将有助于获得高特异性。

 

3.确保反应使用足够的模板。一般而言,Ct 应低于30,以生成足够的材料,实现准确的熔解分析。

 

除了上述的高效稳健的HRM分析预混Mix产品,Solis BioDyne为客户提供终点PCR(end-point PCR),qPCR(real-time PCR),反转录PCR(Reverse transcription),以及其它PCR所需的配套试剂。产品线纵览图如下:

 

PCR配套试剂

 

Solis BioDyne来源于欧盟-爱沙尼亚共和国,专注PCR领域超过24年,Solis BioDyne一直致力于开发和生产高品质的生命科学试剂,现已成为当今欧洲领先的试剂供应商之一。高标准的生产标准和服务使Solis BioDyne成为全球值得信赖的首选PCR供应商。我们的DNA聚合酶,PCR Master Mixes,qPCR Mixes和其它试剂被全球110多个国家的研究者所使用,包括顶级研究机构和生物技术公司。

 

Solis BioDyne拥有独家的蛋白质稳定技术专利,确保其PCR酶与PCR Mixes产品具有极高的稳定性,研究者可以常温运输以及常温下配置PCR反应体系(无需冰盒)。即使是室温放置30天,其酶活性也没有损耗。

 

作为Solis BioDyne在中国的区域总代理,艾美捷科技有限公司将为中国客户提供最全面的Solis BioDyne产品以及订制服务。

 

 

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