关于酵母双杂交系统你需要知道这些

分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展,为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势,已出现了很多新技术,酵母双杂交就是其中的一种。那么我们就来简单了解下啥是酵母双杂交系统:

 

酵母双杂交系统的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究,典型的真核生物转录因子, 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构: DNA结合结构域(DNA-binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域(activating domain,AD)。前者可识别DNA上的特异序列, 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游, 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。

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酵母双杂交模型

 

DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。

 

Fields首先建立了一个双杂交系统,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用,将Snf1与BD融合,Snf4与AD融合,构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶,Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY:171 菌株,该菌株含有LacZ报告基因,并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近,激活了报告基因LacZ的转录。一般地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。因此,酵母双杂交可以简要概括为:基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近,诱导了基因的表达。

 

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞, 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:

  1. 易于转化、便于回收扩增质粒。
  2. 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
  3. 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ), 从而可分析蛋白间的结合作用。如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。

 

利用酵母双杂交筛选基因

 

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。主要是由于:

  1. 采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
  2. 杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
  3. 通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
  4. 信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。

 

蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础,研究反式作用因子之间的相互作用,具有其独特优势:

  1. 融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行,蛋白质保持天然的折叠状态,蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。
  2. 双杂交系统的敏感度非常高,蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。
  3. 在筛选文库时,双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列,省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。

 

说了这么多,其实酵母双杂交并不止这一种模式,经过科学家的不断努力和创新,现在常用的酵母双杂交系统还有基于分离的泛素的膜蛋白酵母双杂交及基于Ras信号通路的酵母双杂系统。这个系统的基本思路和上文介绍的经典系统基本一致,只是将互作的场所搬到了细胞膜上,由于涉及到膜蛋白的方向性,在载体选择和实验设计上较经典模式更复杂。这个系统使用的是酵母细胞的温度敏感型菌株,利用的是蛋白的互作激活Ras信号通路才能使酵母细胞在低温下存活的思路。

 

酵母双杂交技术以其简便,灵敏,高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点,在蛋白互作的研究中将得到更为广泛的应用。另外,在酵母双杂交的基础上,现在又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。以后再给大家一一介绍。

 

lamin b1tel

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