2,5-己二酮(HD)是一种重要的正己烷生物活性代谢物，介导了母体化合物的神经毒性。越来越多的证据表明，过度激活的自噬可能导致自噬性神经元凋亡;然而，过度自噬是否参与HD诱导的神经毒性仍不清楚。探讨HD对自噬的影响,发现其潜在的机制,我们分别用5，15，25mM HD对VSC4.1细胞处理24 h。我们的结果显示HD诱导剂量依赖性方式的VSC4.1细胞过度自噬,同时,过度激活自噬明显减少了PI3K活化剂或Akt激活或mTOR活化剂的产生。这些结果表明HD通过抑制PI3K/Akt/ mTOR信号通路来诱导VSC4.1细胞过度自噬。LDH实验表明HD会导致浓度依赖性VSC4.1细胞死亡增加，而PIK-III是一种自噬抑制剂，可显著降低VSC4.1细胞的凋亡。这些结果也表明HD通过信号通路诱导VSC4.1细胞自噬性死亡。
正己烷是一种有机溶剂，广泛应用于胶水、清漆、涂料、制鞋、印刷油墨、食品等行业。神经毒性正己烷可引起人和实验动物中枢周围神经病变;因此，正己烷引起的神经毒性损伤是一种主要的职业健康危害。正己烷通过吸入或穿透皮肤进入人体。正己烷一旦进入机体，就会被肝细胞色素P450代谢为一系列代谢物，包括：2,5-庚二酮、6,6-辛二酮、2,5-己二酮(HD)，然后通过血液分布到大脑、肝脏、肾脏等各个器官。其中，临床证实HD是介导母体化合物神经毒性的主要毒性代谢物。此外，人的尿中HD的排泄被认为是暴露于正己烷的生物学指标。
自噬作用是一个进化保守和高度调控的稳态过程，通过该过程中的移除和溶酶体系统转化，细胞质大分子和细胞器将会被降解。在正常生理条件下，自噬在细胞生长、发育和稳态中发挥着重要作用，并有助于维持细胞产物的合成、降解和随后的循环之间的平衡。自噬缺陷被发现与神经退行性疾病中的神经元丢失有关，在这种疾病中，异常的蛋白质和受损的细胞器无法从神经元中清除。然而，过度或持续的自噬通过过度的自我消化和必要细胞成分的降解触发非凋亡程序性细胞死亡(自噬细胞死亡)。自噬诱导和随后的神经元死亡发生在神经系统的几种病理状态下，包括缺血、创伤、几种毒物诱导的神经毒性和神经退行性蛋白聚集疾病。许多研究报道，过度的自噬激活，作为对缺血损伤的反应，参与了自噬细胞的死亡，抑制过度的自噬能够减少脑缺血相关神经元的死亡。最近的证据表明，谷氨酸介导的氧化应激导致小鼠海马HT22细胞自噬，自噬增加导致自噬神经元死亡。Pb暴露增加了自噬激活，并导致治疗大鼠海马自噬细胞死亡；然而，目前尚不清楚过度自噬是否与HD诱导的神经毒性有关。
自噬调控的分子机制需要一个非常复杂的生物学过程，涉及多个但不同的信号通路。PI3K/Akt通路是参与细胞生长的信号转导通路的中心调节因子，也是参与细胞生长、细胞存活和代谢的信号转导通路的调节因子。越来越多的证据表明，PI3K/Akt通路在调节自噬性神经元死亡中起着关键作用。郑等报道，褪黑激素通过增强PI3K/Akt通路的激活抑制缺血/再灌注诱导的自噬。研究还表明，抑制PI3k/Akt通路可导致心肌细胞自噬性死亡。Akt也被称为蛋白激酶B，是PI3K/Akt信号通路的主要介质。Akt位于PI3-K信号通路下游，被磷酸化激活。雷帕霉素激酶哺乳动物靶点(mTOR)是自噬过程的主要调控因子，是PI3K/AKT通路的下游靶点。
Akt的活化形式磷酸化Akt可以激活细胞内的另一种mTOR。自噬的抑制依赖于mTOR信号的激活。Zhang等研究表明，铅暴露通过抑制Akt/ mTOR信号通路诱导大鼠海马自噬和自噬细胞死亡。据报道，二氧化硅纳米颗粒通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导内皮细胞自噬。这些研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路失活诱导自噬。在最近的一项研究中，我们发现HD显著下调了治疗大鼠脊髓和坐骨神经Akt磷酸化水平。因此，我们感兴趣的是HD是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导过度的神经细胞自噬。
本研究将背侧运动神经元细胞系腹侧脊髓4.1 (VSC4.1)细胞分别用0、5、15、25mMHD处理24 h，通过免疫荧光、western blot、透射电镜(TEM)检测自噬激活情况。western blot检测PI3K/Akt/mTOR自噬通路的一些重要调控蛋白。为了进一步证实该信号通路参与hd诱导的过度自噬，我们对VSC4.1细胞进行了740Y-P (PI3K激活剂)、26 SC79 (Akt激活剂)27和3BDO (mTOR抑制剂)v28的干扰试验。
为了证明过量的自噬是导致治疗组VSC4.1细胞死亡的主要原因，LDH检测在hd -陶醉的VSC4.1细胞中进行，无论是否含有PIK-III, PIK-III是一种自噬抑制剂。我们的研究结果表明HD通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导VSC4.1细胞自噬性死亡。本研究为HD的神经毒性可能与过度自噬死亡有关提供了证据。此外，我们的发现可以为抗自噬治疗hd诱导的神经病提供新的思路。
图1 HD诱导VSC4.1细胞过度自噬，且自噬呈剂量依赖性。(A)采用LC3和DAPI免疫荧光染色检测0、5、15和25 mM HD处理的VSC4.1细胞的自噬;黄色框表示放大率。酒吧规模:20毫米。(B)细胞的百分比显示的积累LC3点状的报道(D)电子显微图的形态变化VSC4.1细胞治疗0,5、15和25毫米高清,红色箭头表示自噬小体和红色框表示放大,黄色箭头表示自吞噬泡和黄色框代表放大。标尺:500nm。(E)定量分析VSC4.1细胞0、5、15、25mm HD处理后的自噬小泡数量(F) western blot检测p62水平，并定量检测印迹密度。
