免疫比浊技术及其在体外诊断领域(IVD)的应用

 

前情回顾时间分辨荧光技术在体外诊断(IVD)领域的应用

 

免疫比浊法Turbidimetric inhibition immunoassay)也被称作免疫浊度法,是一种将现代光学测量仪器、自动分析检测系统与抗原抗体免疫沉淀反应相结合的技术。当溶液中的抗原抗体发生特异性结合形成免疫复合物,免疫复合物会从液相析出使溶液产生一定的浊度,当有光线通过溶液时,光线在碰到抗原抗体复合物后就会产生折射或吸收,测定这种折射和吸收后的透射光或散射光,即可得到溶液的浊度,进而计算出样品的含量。利用免疫比浊平台能够准确的对液体介质中的微量抗原、抗体、药物及其他小分子半抗原物质进行测定,在临床上具有广泛的应用。

 

免疫比浊原理

 

当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时,形成小分子可溶性免疫复合物,形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下,自液相析出,形成微粒,使反应液出现浊度,当反应液中保持抗体过剩时,形成的复合物随抗原量增加而增加,反应液的浊度亦随之增加,反应液浊度与抗原含量呈正相关。当光线通过反应液时遇到这些微粒后会形成折射或吸收,对透射光或折射光强度进行测定即可得到反应液浊度。用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验,制备标准曲线,即可求出标本中抗原含量。

 

免疫比浊原理示意图

免疫比浊原理示意图

 

抗原抗体复合物形成与光浊度的关系

 

抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素,反应物抗原与抗体的比例决定了复合物颗粒的大小。抗原-抗体复合物形成可以分为三步:

  • 初步形成抗原-抗体二元复合物
  • 复合物交联成大的网络状复合物;
  • 复合物产生絮状沉淀。

 

抗原抗体在等价时,抗原和抗体全部结合,即无过剩的抗原,也无过剩的抗体,这时复合物的形成和解离相等;当反应液中抗体过量时,复合物随着抗原量递增至而增加,至抗原抗体量相当时反应液浊度达到最高点;当抗原过量时,复合物小,光散射少。所以在比浊法中必须在反应液中抗体过量时进行。

 

免疫比浊分类

 

按测定方法分类

按照测定方法的不同可以将免疫比浊分为终点浊度测定法和速率浊度测定法,前者是测定抗原与抗体结合反应完成后测定其复合物的量,后者是在抗原与抗体反应的最高峰(约1分钟)测定其复合物形成的量。

 

按照检测仪器分类

当光线遇到免疫复合物时会发生透射或散射,对透射光或散射光进行检测均可测得反应液浊度,因此可以按照检测仪器将免疫比浊分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。

免疫透射比浊法:入射光线与光度接收器在同一水平面上的检测方法,目前临床应用较多的是免疫透射比浊技术。

免疫散射比浊法:入射光线与光度接收器不在同一水平面上的检测方法(光度接收器与水平面形成0°到90°的夹角)

 

按照有无增强作用分类

按照有无增强作用可以将比浊分为普通免疫比浊胶乳增强免疫比浊

普通免疫比浊:值抗原抗体直接反应产生浊度进行分析的方法。

胶乳增强免疫比浊:即指羧基化聚苯乙烯微球通过EDC偶联上抗体,再于抗原反应,起到信号放大作用的方法。

 

免疫比浊试剂盒

在临床诊断过程中,免疫比浊平台由检测仪器及免疫比浊试剂盒两部分组成,下面就免疫比浊试剂盒做一介绍。免疫比浊试剂盒一般包含3部分:

检测试剂:又分为试剂R1和试剂R2,试剂R1主要是缓冲盐体系,提供抗原抗体比较适宜的反应条件;试剂R2主要成分就是抗体(胶乳比浊试剂盒R2试剂为偶联上抗体的羧基化聚苯乙烯胶乳微球),R2试剂制备是免疫比浊试剂盒的核心技术。

校准品:为检测试剂在生化仪上制作标准曲线的定制和抗原样品。

质控品:为检测试剂在生化仪上的重复性,稳定性的定值抗原样品。

 

免疫比浊试剂盒评价

免疫比浊试剂盒评价主要包括以下内容:

精密度:包括批内精密度和批间精密度;

线性范围:评价试剂在一定范围内的线性程度;

准确度:评价试剂与其他厂家是否具有可比性;

抗干扰能力:评价试剂在一定干扰物质存在的条件下,测试值与理论值的差距是否在合理范围内;

稳定性:包括上机开瓶稳定性,实时储存稳定性及运输稳定性;

 

临床需求

目前人体中已发现的血浆蛋白有1000种以上,各自执行着不同功能,在研究中的约有500种,分离成纯品的约有200种,在临床上已应用的约有50种左右。这些特定蛋白在许多病理条件下会发生相应的变化,因此对其进行定量检测,可以为临床诊断,判断疗效,分析预后提供重要的依据。因为这些蛋白都具有”某一特定抗原性”,多采用免疫方法对其进行检测。临床对于定量的需求越来越强,促使免疫比浊法应运而生。

 

免疫比浊技术临床上的应用

免疫功能监测:免疫球蛋白A、免疫球蛋白C、免疫球蛋白M、免疫球蛋白轻链k,免疫球蛋白轻链λ、补体C3、补体C4等。

心血管疾病检测:载脂蛋白A1、载脂蛋白B、脂蛋白α等。

炎症状况检测:C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、降钙素原、铜蓝蛋白等。

类风湿性关节炎检测:类风湿因子、C-反应蛋白、抗链球菌溶血素O等。

肾脏功能监测:尿微量白蛋白、α1微球蛋白、β2微球、转铁蛋白、免疫球蛋白G等。

营养状态监测:白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白等。

新生儿体检:C反应蛋白、免疫球蛋白A、前白蛋白、免疫球蛋白G等。

凝血及出血性疾病的检测:抗凝血酶Ⅲ、触珠蛋白等。

药物浓度检测:丁胺卡那霉素、卡马西平、庆大霉素、苯巴比妥、苯妥因奎尼丁、妥布素等。

 

 

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