文献解读|植物自养生长的秘诀是什么?β5亚基给你答案

 

Abbikine产品:Anti-Plant Actin Mouse Monoclonal Antibody (3T3) (A01050; Abbkine, Wuhan, China)
英文名:The β5 subunit is essential for intact 26S proteasome assembly to specifically promote plant autotrophic growth under salt stress
中文名:β5亚基是完整的26s蛋白酶体组装所必需的,在盐类协助下促进植物自养生长
作者单位:遗传与发育生物学研究所
研究方向:植物生理生化
杂志名称:New Phytologist (2018)
影响因子:6.65

 

研究背景:

 

植物生长发育过程中几乎所有方面都受到多肽合成和前体蛋白降解的调节,蛋白酶体是细胞的主要蛋白分解机制;它降解真核生物中错误折叠、改变或短暂存在的蛋白质。蛋白酶体通常作为泛素的最终蛋白水解成分26S蛋白酶体系统。26S蛋白酶体是一种大型蛋白质复合物,由两个亚复合体组成:催化20S核心粒子(CP)和19S调节粒子(RP)。20s-cp存在于生命的所有三个王国中,并在泛素结合蛋白的细胞转换中发挥重要作用。晶体结构研究表明,真核20s蛋白酶体由a环和b环组成,它们以伪七倍对称性(a1-7b1-7b1-7a1-7)组装。在真核生物20s蛋白酶体中有三种蛋白酶活性催化亚基-pba(b1)、pbb(b2)和pbe(β5),但其他b型亚基和所有a型亚基已知是非活性的。pbe的突变,而不是pba或pbb的突变,在酵母中是致命的,这表明pbe对蛋白酶体活性是必不可少的。

 

26s蛋白酶体的19s-rp与20s-cp的一端或两端相关,并赋予单泛素和多泛素链对靶点的特异性。蛋白酶体亚单位突变与许多疾病相关,包括心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和癌症。在人类中,除了标准蛋白酶体外,还有三种组织特异性形式/类型的20s蛋白酶体:免疫蛋白酶体,在免疫系统的细胞中起作用,如T细胞等;THY在胸腺皮质上皮细胞中起作用的MOP蛋白酶体;以及精子发生所需的睾丸精子蛋白酶体。氧化应激也可以诱导所谓的“应激蛋白酶体”的形成。这些特殊形式的蛋白酶体被证明在特定的细胞环境(如细胞类型特异性或应激诱导)中介导特定蛋白质的降解。然而,目前还没有关于植物中这些细胞环境依赖性蛋白酶体形式的报道。有趣的是,编码20s蛋白酶体亚型(b1din、a3din和a6din)的三个基因的转录是由植物防御反应的蛋白诱导子诱导的。这一发现提示了植物中蛋白酶体的应激特异性形式的可能性。

 

作为固着生物,植物必须调整其生长发育程序,以应对环境胁迫,如土壤盐分和干旱。脱落酸(ABA)是一种重要的植物激素,在植物对干旱和盐胁迫的反应中发挥作用。已知许多ABA信号通路蛋白的活性受翻译后修饰的调节,这些蛋白的稳定性也受泛素26s蛋白酶体系统的调节。在这里,我们比较了盐胁迫处理和未处理的拟南芥幼苗中纯化的蛋白酶体,发现盐胁迫增加了pbe蛋白(β5核心蛋白酶亚基)的丰度。因此,我们的研究揭示了植物中存在一种细胞背景依赖的蛋白酶体形式(胁迫诱导),并证明了该pbe1的ABA信号介导的功能是植物发育的调节因子。

 

实验目的

 

泛素26s蛋白酶体(26sp)系统能有效降解植物发育的许多关键调控因子。26sp由催化20s核心粒子(cp)和19s调控粒子(rp)组成。以往的研究主要集中在19srp上,目前还不清楚20srp中是否有一个特定的亚基在植物中具有应激相关的生物学功能。

 

pbe1是拟南芥蛋白酶体cp的β5亚基之一,对盐胁迫幼苗中26sp的组装和蛋白水解酶活性至关重要。pbe1的表达是应激诱导的。盐胁迫下幼苗从种子萌发到自养生长的转变过程中,pbe1功能的丧失特别导致发育转变的停滞,而不是萌发和萌发后的生长。pbe1对其他类型的蛋白酶体应激和内质网应激也很重要。

 

pbe1调节转录因子abi5的蛋白质水平,从而下调该关键调控因子下游的几个基因的表达,这些基因对植物在逆境下生长至关重要。

 

总之,我们的研究结果显示pbe1介导的完整蛋白酶体组装是成功自养生长所必需的,并且揭示了pbe1介导的胁迫蛋白酶体如何在植物中控制蛋白酶体活性和脱落酸介导的胁迫信号。

 

材料与方法

 

  1. 蛋白酶体纯化
  2. 蛋白酶体活性测定
  3. 植物材料和生长条件
  4. 植物转基因的分析
  5. 蛋白酶体组装试验和WB
  6. RT-PCR和定量RT-PCR

 

实验结果

 

盐和ABA处理均增加了20s蛋白酶体亚基pbes的积累

泛素-蛋白酶体依赖性蛋白降解是真核生物多种应激反应的重要过程,蛋白酶体功能异常与许多哺乳动物疾病有关。许多研究表明,植物可能具有某种形式的应激蛋白酶体。为了探讨在拟南芥中是否确实存在应激特异性蛋白酶体形式,我们使用转基因拟南芥植株表达标记的20s蛋白酶体亚基。pag1在pag1-1突变背景下,利用亲和纯化技术从盐胁迫和未处理的幼苗中分离出20s蛋白酶体。我们通过LC-MS/MS对纯化的蛋白酶体进行分析,发现许多肽谱在PBE1和PBE2中都匹配,一些肽谱在PBE1(AT1G13060)或PBE2(AT3g26340)中唯一匹配(图1A、C)。质谱分析显示,在盐胁迫下,与多溴联苯相匹配的肽谱百分比(psms%)增加(图1a)。为了证实观察到的差异聚集,我们产生了一种针对pbes的特异性抗体(图s1a),并且发现pbes的数量确实在盐胁迫下增加(图1b)。除盐胁迫处理外,我们还用ABA处理幼苗,ABA是一种在植物盐胁迫反应中起重要作用的植物胁迫激素;这种处理也增加了pbes的积累。

 

拟南芥20s蛋白酶体pbe亚基的鉴定及序列分析

图1 拟南芥20s蛋白酶体pbe亚基的鉴定及序列分析

 

酵母中只有一个编码pbe的基因。哺乳动物有三种pbe亚型(β5、β5i和β5t),每种亚型具有不同的功能。拟南芥基因组包含两个假定的同源Β5亚基基因,PBE1和PBE2,它们可能编码两个PBE亚型,它们具有很高的蛋白质序列同源性(92%)(图1C)。迄今为止,还没有研究报告这些蛋白质的功能。

 

pbe1突变体幼苗比野生型幼苗对盐和ABA处理更敏感

首先我们测量了pbe1和pbe2基因的转录。在未经处理的野生型(WT)植物中,pbe1的表达大约是pbe2的10倍(图2a,b)。盐胁迫和ABA处理均诱导了这两个基因的表达,但pbe1的诱导作用更强。与未诱导的pbe2表达相比,盐/ABA处理的植株pbe1表达高20倍,pbe2表达高1.5倍(图2b)。我们观察到盐和ABA处理诱导了pbe基因的表达(图2b)并增加了20s蛋白酶体亚单位pbe的积累(图1b,s1b),我们获得了pbe1(pbe1-2)和pbe2(pbe2-1)的t-dna敲除突变,以研究潜在的应激相关这些副记录的功能(图s2a、2c、d)。我们比较了pbe1-2、pbe2-1和wt植物从种子萌发开始到自养生长开始的盐胁迫和ABA敏感性。我们注意到,在对照培养基上生长时,野生型和多溴联苯副木突变体的种子发芽率或子叶绿化率没有差异(图2c)。

 

在盐胁迫或ABA培养基上生长的pbe突变体种子的发芽率与wt没有显著差异,但在盐胁迫或ABA培养基上生长的pbe突变体种子确实产生了明显的子叶绿色表型。而wt和pbe2-1植株的子叶都变绿了,pbe1-2子叶却没有变绿(图2c)。我们还产生了两个互补系,发现在pbe1-2背景中表达的pbe1在盐胁迫和ABA培养基上都补充了突变表型(图2e,f)。这些遗传学实验的结果表明,pbe1具有应激反应相关功能。值得注意的是,在pbe1/pbe1 9-pbe2/pbe2杂交的f2代后代中,不能获得纯合的pbe1-pbe2双突变体。未能获得该基因型的植株表明,pbe1和pbe2同时丧失是致命的。

 

PBE1和PBE2在功能上是冗余的,但在盐胁迫下只有PBE1参与了植物自养生长的转化

如前所述,pbe1和pbe2的氨基酸序列非常保守(图1c)。为了研究pbe1和pbe2可能的功能冗余,我们在pbe1-2突变背景中表达了pbe1或pbe2(由相同的pbe1启动子驱动)。我们证实了这两个转基因系中pbe1和pbe2的表达(图s2b)。propbe1:pbe1结构的表达,以及propbe1:pbe2结构的表达,挽救盐胁迫-和ABA处理诱导pbe1-2植物的非绿色表型(图2e,f)。这些结果表明,pbe2和pbe1在盐胁迫植物中表达水平相似时,在功能上是冗余的。pbe1和pbe2的启动子对其表达差异具有重要意义。

 

pbes在拟南芥和pbe1突变体中的表达对盐胁迫和脱落酸(ABA)更为敏感

图2 pbes在拟南芥和pbe1突变体中的表达对盐胁迫和脱落酸(ABA)更为敏感

 

创新点

 

26s蛋白酶体在发育和应激反应过程中的选择性蛋白质降解中具有重要作用。在哺乳动物中首次观察到特异性蛋白酶体形式。在人类细胞中的一项开创性研究发现,ifn-γ大大增加/减少了至少6个蛋白酶体基因的mrna转录丰度。在动物中,除了标准蛋白酶体外,中间蛋白酶体和免疫蛋白酶体以及其他催化亚单位对细胞死亡和疾病感染期间错误折叠和氧化蛋白的降解也很重要。果蝇睾丸中也发现了组织特异性蛋白酶体形式:两种由同源基因编码的a4亚基在雄性生殖系中独家表达。对人肺的进一步研究表明,胸腺特异性蛋白酶体亚单位在胸腺皮质上皮细胞中特异表达,该亚单位在t淋巴细胞的阳性选择中起重要作用。

 

一些证据也表明,植物中可能存在细胞环境特异性蛋白酶体形式,表明植物防御反应诱导过程中b1din、a3din和a6din蛋白酶体亚基的不同积累。后来,同一个实验室发现,含有b1诱导亚基的蛋白酶体在活性氧物种(aos)的生产中可以作为nadph氧化酶的负调节因子。因此,作者预测了“植物防御蛋白酶体”的存在,该蛋白酶体可能参与了精细控制aos生产的多组分调控系统。尽管这些令人兴奋的发现,广泛的生化研究需要更充分地说明泛素-蛋白酶体介导的蛋白质水解在植物防御反应中的意义。

 

在拟南芥幼苗中进行的一项系统的、基于亲和纯化的研究发现,许多蛋白酶体亚基在翻译后被修饰,例如通过乙酰化和/或泛素化。这意味着蛋白酶体似乎表现出细胞背景的特异性,并可能在蛋白质水解中具有不同的功能。最近,一项研究报道了盐胁迫下番茄根中pbb(b2)和pbe(β5)亚基的翻译后修饰,尽管所观察到的修饰的确切性质仍然未知。在本研究中,我们发现虽然pbe 20s亚基的两个同源亚型在蛋白质水平上具有高度相似的功能,但是它们的差异表达,特别是它们在盐胁迫下的差异细胞积累(例如,20倍的高表达在pbe1的积累中),实际上是控制我们在拟南芥突变体中观察到的自养生长转化表型的细胞环境依赖性蛋白酶体的组成。

 

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