SWATH技术在蛋白质组学等多领域的应用

对于SWATH技术大家可能都不太清楚,不过提到蛋白质组学科研狗们应该是有所耳闻了,我们先来聊聊蛋白质组学吧。蛋白质组(proteome)这个词,是澳大利亚科学家Williams和Wilkins于1994年首先提出的,它是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质总和,是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体。二十多年的时间里,蛋白质组的研究取得了惊人的进展,这相当程度上要归功于质谱技术在蛋白质组中的应用和不断发展。同时,蛋白质组和基因组的发展是相辅相成的,凡是经过基因组测序的物种,都可以用质谱技术大规模鉴定其蛋白质组成。

 

那么什么是SWATH技术呢?

 

SWATH技术

SWATH技术示意图

 

SWATH(Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra)是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX联合推出的一项全新的质谱技术。它的基本原理是:依靠4个杆间电场的变化来选择离子。图1中,第一个四级杆Q1选择一定质荷比的离子,第二个四级杆Q2作为碰撞室,诱导碎片化反应,而后在质量飞行器TOF中扫描碎片离子。

 

SWATH 采集技术是一项突破性技术,它让分析人员只需一次分析,就能同时对样品中几乎所有可检测的化合物进行全面鉴定和定量分析 (MS/MSALL)。它将扫描范围划分为以25 Dalton为间隔的一系列区间,通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息,以蛋白质组学样品分析中常见的扫描范围400~1200为例,每25Dalton作为一个扫描间隔(SWATH),每个SWATH扫描时间设定为100ms,那么该扫描范围累计需要32个SWATH(1200-400/25=32),完成一次扫描仅需要3.2秒。与传统的shot-gun技术相比,SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息。因此,SWATH技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。同时也解决了shot-gun鉴定较低重复度的缺点。

 

此外,2010年,AB-SCIEX公司推出Triple-TOF 5600系统,Triple-TOF 5600 是AB-SCIEX公司在三重四极杆质谱仪API 5500 和四极杆-飞行时间质谱仪QSTAR  Elite(QqTOF)系统的基础上发展出的具备强大定性和定量能力的高分辨率质谱仪,成功地将三重四极杆和飞行时间质谱的最新技术合二为一,是第一台集高准确质量数、高分辨率、高扫描速率和高灵敏度为一体的系统,能够在一台仪器上“同时”达到高灵敏度、高分辨率、高质量准确度和高质谱图采集速度,而且还具备三重四极杆质谱级别的定量能力。。SWATH技术和TripleTOF 5600的完美结合让SWATH技术发挥到了极致。借助先进的Triple-TOF 5600质谱系统,SWATH在定量上具有较高的准确度和动态范围。与传统的基于质谱定量方法不同,基于SWATH技术的定量方法直接构建二级碎片离子的XIC,曲线上的每一个点都有充分的质谱证据,大大增加了定量的准确度和可重现性。科学家运用SWATH采集模式对酵母细胞全蛋白质的裂解液进行了分析,实验结果显示检测到蛋白质的丰度差异极大,跨越了4个数量级。而且该方法的灵敏度和动态范围与SRM分析水平相当。下面归纳总结下:

 

SWATH技术特点

 

灵敏度高——SWATH技术继承了MRM的数据采集模式,结合高分辨率的Triple-TOF5600 plus质谱系统,具有与MRM相当的灵敏度;

可重现性高——重复样品间的定量相关性可达到0.99以上;

定量准确度高——定量准确度几乎与MRM技术相当;

线性动态范围广——定量范围可跨越4个数量级;

通量大——一次实验可检测到2000种以上蛋白并定量。

 

SWATH技术的应用

 

使用SWATH技术研究蛋白质组学在国外已经有了不少应用。Ruedi实验室已经先后发表了4篇应用SWATH技术相关的paper。其中2013年9月在Nature method杂志上发表的利用亲和纯化结合SWATH技术(AP-SWATH MS研究蛋白相互作用的文章(Nature Methods 10,1239–1245(2013))非常值得借鉴。SWATH技术用途广泛,最常见的有以下这些:

 

1、蛋白质组定量

对细胞、组织或器官中含有的不同时期、不同条件下蛋白表达水平的研究,生物标志物的寻找都需要对蛋白质进行鉴定和定量,蛋白质组定量已成为研究生命科学的主要手段。SWATH定量方法基于提取Transition峰面积计算出肽段含量,通过肽段含量推理出蛋白质含量的方法。SWATH定量应用到proteome-wide水平就产生了SWATH定量蛋白组,以此方法为基础可以迅速锁定几个样品间的差异蛋白质(类似于iTRAQ定量蛋白质组)。

 

2、蛋白复合体鉴定

在所有生物功能中,蛋白质复合物的功能占主导地位;在所有细胞功能中,蛋白质间的相互作用是最基本的活动。研究蛋白质组相互作用的方法主要有酵母双杂交技术(Y2H)、亲和纯化(AP)、化学交联偶联质谱CXMS)等方法。其中AP技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下,能捕捉出特定的蛋白质及其分子伴侣。SWATH和AP技术联合使用确定蛋白复合体的成分是SWATH定量方法最常用的应用之一,目前已经非常成熟。

 

3、宿主蛋白(HCPs)分析

由于宿主细胞蛋白(HCP)等污染物会引发病人的不良反应,所以药品中HCP的检测和定量分析是必不可少的。从1997年开始,EMA(欧洲药品管理局)法规已经要求必须证实药品中已经去除HCPs。质谱能够在快速有效分析HCPs的同时确保更好的准确度,TripleTOF系统搭配SWATH采集模式分析HCPs,可以全面、准确定量分析的同时获得MSMS信息,一次进样即可完成任意数量HCPs的定量分析工作,并在30分钟的LC梯度内,完成ppm级HCPs的含量测定。

SWATH技术如今已广泛用于蛋白质组学研究,现在还可以为食品检测、环境分析、药物开发、疾病诊治、法医检测等其他领域的分析提供极大优势。

 

食品检测方面,可利用SWATH技术调查食品成分和产品是否符合质量和安全要求。根据要求,某些食品(例如婴儿食品)中的农药残留不得超过 10 µg/kg,而水果或蔬菜等食品通常含有大量活性成分,可能很难进行分析。使用传统的 LC-MS/MS 方法分析食品等复杂基质时,鉴定中可能会漏掉重要的微量残留物。SWATH 采集技术可以完整调查到样品中存在的每一种可检测化学污染物,同时还能迅速、可靠地检测到通常被样品中的主要化合物掩盖的微量化合物。

 

环境监测工作者的主要任务是鉴定水质、大气等样品中的各种有害化学物质。水质分析的难点在于物质浓度可能极低(在每升几纳克的范围内),而且单个样品可能包含数百种污染物。SWATH 技术可收集所有可检测峰的超高质量 MS 和 MS/MS,从而对样品中的化合物进行迅速、可靠的鉴定和定量分析。

 

开发生物治疗药物的过程中,宿主细胞蛋白质的表征和定量是一个重要阶段。即使经过严格的净化过程,最终产品中也可能出现少量宿主细胞蛋白质。传统的分析方法(如 ELISA)无法全面检测事先未知的 HCP(宿主细胞蛋白质)污染物,而依赖标准信息的 LC-MS 方法不具备以可重现方式检测微量肽的灵敏度。相比之下,SWATH 采集技术是一种全面的检测方法,可检测样品中极微量的肽,从而让研究人员能够生成对药物开发研究至关重要的可重现数据。

 

在疾病诊治方面,有研究者运用SWATH定量质谱技术比较研究了膝骨关节炎(KOA)、类风湿性关节炎(RA)以及半月板损伤患者关节滑液蛋白质谱的差异。结果表明,差异蛋白主要来源于细胞外基质、细胞膜、细胞质、分泌颗粒、脂蛋白复合物等成分;分子功能主要为酶活性、酶抑制剂活性、结合、转运和调节活性等;主要参与对创伤的急性炎症反应、补体的活化、免疫应答、对刺激的反应、细胞凋亡的调控、内稳态的维持等生物过程。寻找并初步明确KOA关节滑液中的特异性生物学标志,为该病的早期诊治、疗效监测和预后评估提供了可靠的、精准灵敏的参考指标。

 

对于法医检测,涉及对大量生物基质(如血液)中的药物进行筛查和定量。这项检测要求可靠的硬件、可重现的结果和高度灵敏的分析技术。SWATH 技术可通过一次进样收集全面的 MS 数据和 MS/MS 数据,从而建立法医样品的数字档案。这样可以实现样品的重复解析,而且不需要重复进行物理分析,也不需要花费大量资金和精力储存样品,还能节省时间。这种全面的解决方案还可以提供作为“呈堂证供”的高质量结果。

 

从传统蛋白质组学工作流程到 SCIEX 获得专利的 SWATH采集技术的过渡,已为蛋白质组学试验带来变革,让研究人员能够在超大型样品组之间稳定高效地采集所有数据。随着科学技术的发展,SWATH 采集技术以其定量分析的高准确性及重复性,将为更多研究领域带来新的变革。

 

SWATH技术的信息分析内容

SWATH 参考谱图数据库构建:通过DDA模式的扫描结果,谱图数据库构建、全谱鉴定及结果可靠性评估。

SWATH定量:根据二级碎片离子的全扫描结果实现二级离子的定量;SWATH结果可靠性分析;差异表达分析;层次聚类;PCA分析等。

蛋白质功能注释:包括GO注释、COG分类和KEGG Pathway分析。

差异蛋白功能富集:包括GO富集、Pathway富集。

差异蛋白网络互作:基于STRING 数据库的PPI分析,基于Cytoscape的可视化展示。

 

lamin b1tel

每日生物评论

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: