超分辨率显微镜分析,荧光抗体该怎么选?

 

1873年,德国医师Ernst Abbe 提出了“衍射极限”的概念。他预测,由于光的基本衍射性质,光学显微镜无法实现200nm以下的分辨率。实际上,当两个相隔很近的物点同时发光时,得到的图像是模糊的,无法分辨。超分辨率显微镜(SRM)的诞生打破了一个世纪多以来一直被认为无法突破的瓶颈。

 

如今,科学家们已经研发了多种超分辨率技术,远远超出了衍射极限,能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平,从而获取有关细胞组分的3D结构的信息,并可以观察到单分子共定位。

 

下面我们来简要概述了时下几种最流行的SRM技术的原理:

 

SRM技术原理

 

1.受激发射耗竭(STED)显微镜

 

STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单,该方法和普通共聚焦显微镜(Confocal)的原理相同。普通Confocal使用单光源,而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签(研究者们以此来定位和观察蛋白)的光,另一个光源发出不同波长的光,用于抑制荧光。这束光是环形的,并且与第一束光有所重叠,因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

 

获得STED超分辨率图片并没有那么复杂,用户需要仔细调整参数,才能得到漂亮的结果,否则所得图片和普通confocal没有差别。

 

1.受激发射耗竭(STED)显微镜

使用传统和RESCue受激发射减损显微镜(STED)得到的细胞核膜上核孔复合体的图片。

 

STED的原理:

 

显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域,这称为点扩散函数(PSF)(见图1),由于PSF的存在,使得常规显微镜无法达到超分辨。

 

STED的原理

图1:在普通光学显微镜中,成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制,防止了射线的精确会聚,从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数(PSF)的大小,或对象在某个点的三维强度分布。在STED中,应用环形炸弹耗尽型激光器,其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”,从而“抑制了来自零点附近区域的荧光,导致有效PSF的尺寸减小”。

 

而受激发射耗竭(STED)显微镜通过限制样品的荧光区域(PSF)产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光,第一个按照常规显微镜激发荧光团(图2A)。第二个激光器称为耗尽激光器(STED激光器),它激发“甜甜圈”形状的激光,其中心的零强度点非常小(〜30 nm)(未激发)。除了在甜甜圈的中心处之外,第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光,从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处,这有效地降低了PSF,以产生非常小的单分子荧光聚焦区域,从而获得高分辨率图像(图2D)。

 

超分辨率图像

图2

  1. 单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析,从而导致图像模糊
  2. STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”
  3. 饱和耗尽在功能上降低了激励PSF
  4. 随之可以解析单个蛋白质

 

适用于STED的荧光团偶联抗体:

 

为了获得超分辨率,染料必须具有STED激光波长的高发射截面,并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性,具有高的量子产率和对比度,并在目标附近具有足够的标记密度。

 

Jackson提供荧光染料标记的二抗,下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用: AlexaFluor®488(如:115-545-003),FITC(如:715-095-150),AlexaFluor®594(如:715-585-151)和AlexaFluor®647。

 

2. 随机光学重建显微镜(STORM)

 

最有名的“基于探针”的技术是Betzig等人研发的光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和哈佛大学庄小威实验室发明的随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签,随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程,生成一系列部分荧光图,最后重建成整个视野的荧光图。,以产生分辨率优于常规方法收集的图像。

 

随机光学重建显微镜(STORM)

使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

 

Jackson提供适用于dSTORM应用的标记二抗,简而言之,较低强度的激发光激发样品,随机激活少量染料分子。单个发荧光的染料分子足够分散,因此可以计算其点扩散函数的中心,从而推断出染料的确切位置。然后使用第二激光关闭所有分子,并重复该过程。然后,通过重叠每种染料的所有映射点扩展函数,以数学方式生成高分辨率图像。

 

用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体

 

用于单分子定位的最佳染料通常非常亮,并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多种广谱范围内的可靠染料,例如AlexaFluor®488,AlexaFluor®647和Cy™5,可用于这些类型的实验。

 

建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物:

 

STED 激发波长(nm) 发射波长(nm)
Alexa Fluor® 488 493 519
荧光素 / FITC 492 520
Alexa Fluor® 594 591 614
Alexa Fluor® 647 651 667
STORM 激发波长(nm) 发射波长(nm)
Alexa Fluor® 488 493 519
Alexa Fluor® 647 651 667
Cy™5 650 670

 

每种SRM技术都有各自的探针选择要求,Jackson ImmunoResearch提供多种已知在SRM应用中表现良好的荧光标记二抗。应该注意的是,SRM领域变化迅速,因此,建议从专业技术文献中寻求信息,以帮助选择合适的荧光团。

 

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