位点特异性重组酶介绍

我们通常会用到特异性位点重组酶,如我们都熟知的Cre-Lox,TALENs,锌指系统,CRISPR-Cas9,这些都是保守的位点专一性重组(CSSR)。事实上,CSSR是从微小的细菌种借用的技术。尽管这些系统存在于真核生物、原核生物和噬菌体中,但我们通常在基因工程中使用的通常是细菌。特别地,λ噬菌体使用λ整合酶整合到其细菌宿主中,沙门氏菌利用Hin重组酶来表达替代基因。

 

CSSR系统都有共同的特点:

  1. 它们由两个主要元素组成:酶和重组位点。
  2. 重组位点必须存在于DNA分子的重组过程中。它们为酶提供了一个攻击位点,并有助于其特异性。
  3. 根据位点的方向,反应的结果可能是一个DNA片段的删除,另一段的插入,DNA分子内的反转等。
  4. 这个过程是“保守的”,因为在这个过程中每一个DNA键都断裂再重新加入。
  5. 这个过程涉及共价的蛋白- DNA中间体的形成。

 

从结构上讲,有两个重组酶家族:

 

一、酪氨酸重组酶

酪氨酸重组酶类在其活性位点上有一个Tyr残基,其侧链攻击连接到DNA。这一机制是已知的,具体如下:

Recombinant-enzyme-tyrosine1

1.酶的两个亚基附着在两个DNA分子上,值得注意的是,酶没有四重对称——在任何时候,只有两个斜对角的亚基处于活跃的构象中。

Recombinant-enzyme-tyrosine2

  1. 活性亚基的Tyr残基附着在其自身DNA分子一条链上的5’磷酸基上,留下一个游离的3’-OH基团。

 

  1. 3’-OH基团附着在另一DNA分子的暴露磷酸基团上,形成一个霍利迪连结体(Holliday junction)。现在,一条链与另一个DNA分子的同源链结合在一起,而这两个分子中的另一条链保持不变。

Recombinant-enzyme-tyrosine3 Recombinant-enzyme-tyrosine4

4. 然后,酶的相对亚基转化为活性构象,之前的活性构象变得不活跃。这些新的亚基攻击DNA分子未受影响的第二条链,连接到5 '磷酸基时留下一个暴露的3 '-OH末端。

Recombinant-enzyme-tyrosine5

5. 3’-OH连接到不同分子的5 '磷酸基,这样这两个分子经历了重组。

 

二、丝氨酸重组酶

 

丝氨酸重组酶系统在其与DNA结合的活性位点上有一个Ser残基。它与酪氨酸重组酶作用机制的主要区别在于,DNA分子的两条链都断裂,然后将它们连接到相反的分子链上。

 

Serine-recombinant-enzyme1

 

1.两个亚基对附着在两个DNA分子三,每个亚基对应一条链。所有的亚基同时都是活跃的,在每条链上丝氨酸残基攻击5 '磷酸基。

  1. 所有的四条链都断裂,产生了4个3 '-OH基团,它们可以攻击不同分子的相应链。
    蛋白质结构变化,不同链的3 '-OH和5 '磷酸基团发生重排。Serine-recombinant-enzyme2

Serine-recombinant-enzyme3

 

3.DNA链同时连接,产生重组分子。

 

Serine-recombinant-enzyme4

 

三、应用和未来的潜力

 

在使用的重组酶中,大多数是Tyr重组酶系统,如Cre-Lox重组系统。这些方法可以帮助你目的基因敲除,或者用特定的重组位点“播种”胚胎细胞,是以后重组酶的目标。这有助于科学家研究基因,在正常发育的胚胎阶段,它们的删除可能会致命。

 

相比之下,丝氨酸重组酶,如φC31-Int在转基因研究中是有帮助的。它有识别单一重组位点的倾向,酶以几何方式锁定。然而,其在合成生物学中的应用发展迅速,尤其是在E. coli的基因工程表达。

 

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