在前面的《单细胞转录组测序的常用方法》等文章中我们给大家简单介绍了一点与单细胞测序相关的知识。今天我们继续来谈谈与单细胞测序相关的单细胞基因测序。
一、单细胞基因测序的常用方法
单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。
从方法学角度来看，获得高覆盖率高保真性的全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)利用随机引物和等温扩增可以获得高保真的DNA大片段，但该方法的主要缺陷在于非平衡的基因组覆盖率、扩增偏倚、嵌合序列及非特异扩增等。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题。另外，还有科研人员利用DOP-PCR进行全基因组扩增(whole-genomeamplification，WGA)及DNA测序对单个乳腺癌细胞进行了拷贝数变异的分析，进而推断出细胞的群体结构和肿瘤的进化过程。但是由于该方法的基因覆盖率较低，而且不能在单个核苷酸的分辨率上评价单个肿瘤细胞的遗传学特征，故并不能检测在肿瘤发展过程中发挥重要作用的单个核苷酸的改变。
2012年，哈佛大学谢晓亮院士在《Science》发表了单细胞全基因组扩增新技术MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，简称MALBAC)，即多次退火环状循环扩增技术。不同于以往的非线性或指数型扩增方法，MALBAC技术利用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而很大程度上防止了DNA的指数性扩增，从而解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，并使基因组测序的模板需求量从µg级降至单细胞水平。MALBAC技术原理如下:
图1:MALBAC技术原理
MALBAC技术具有如下优势:
- 降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。
- 灵敏度高:单细胞、单染色体或0.5pg的基因组DNA即可进行扩增。
- 扩增均匀性显著优于其它技术，测序数据可进行CNV分析，用于21三体等染色体变异检测。
- 扩增产物用途广泛:可用于二代测序、微阵列、qPCR、基因克隆。
目前，MALBAC技术现在已经成功应用于人类单精子、植入前产前筛查的囊胚和极体、早期发育胚胎、肿瘤细胞、刑侦现场痕量物证和部分微生物。
二、单细胞基因测序在肿瘤基因组研究中的发展
对两种类型乳腺癌细胞进行的单细胞DNA测序结果发现，肿瘤细胞内包含各种类型突变，证实了遗传多样性可能会决定肿瘤进展的方向。一直以来，研究者都盼望着DNA测序的分辨率可以达到单个细胞，这对于研究在许多复杂生物系统内存在的细胞异质性非常重要，尤其是对人类肿瘤基因组混合物的研究而言。Wang等人建立了一种新的测序方法，称作nuc-seq，基本实现了对单个细胞完整基因组进行完全测序的目标。
当细胞准备分裂时，细胞核内DNA会进行复制。通过筛选从而仅仅对新生的“双”核进行测序，nuc-seq可以利用此类复制，获得比之前大部分的测序技术更低的测序错误率。研究者采用靶向双链测序验证了他们的方法，这是一种对DNA双链进行测序，以鉴定突变的方法，具有超高的准确性。他们认为，使用nuc-seq对单细胞基因组进行测序，然后采用靶向深入测序进行验证，应该就可以将癌症中的基因组异质性检测出来。
为了阐明这一点，Wang等人对两种类型的人乳腺癌中的多个单细胞基因组进行了测序，他们并没有发现在遗传学上一模一样的两个肿瘤细胞。除了证实在肿瘤中的大部分细胞都含有大量的突变，研究者还发现肿瘤细胞中含有更大量的亚克隆及从头突变现象（这在个体细胞中是很罕见的）。他们还使用数学方法对肿瘤组织单个细胞内的突变率进行了估算。基于这些模型与方法，他们发现，不同类型的DNA突变在不同肿瘤中以不同的速度累计，而且，在癌细胞内，有两种相互独立的“突变时钟”在运行。DNA内大规模的结构改变（例如大段DNA的扩增和缺失）可能会发生于肿瘤进展的早期，而点突变则是在进程中逐渐积累的。研究结果表明，生长速度更低的luminal亚型乳腺癌细胞的突变率也相对更低，而来自侵袭性更强的三重阴性乳腺癌细胞内的突变速率，则比正常细胞高出13倍。
Nuc-seq及其它相关测序方法可以帮助我们对个体肿瘤内的突变异质性有更加透彻的了解，也会促进我们探究癌症进展及相应治疗方法。尤其是肿瘤内的突变多样性有可能被用于预测在药物治疗中，是否会出现药物抗性，因为导致药物抗性的基因突变很可能在治疗前就已经存在了。这在一些化疗药物无法有效治疗癌症的实际应用中都有所记录。研究结果再一次说明了，单个大样品量的肿瘤组织检测——这是目前普遍用于选择靶向治疗方法的手段——并不能全面检测肿瘤的遗传学特点。
肿瘤基因组内所包含的所有突变数目，包括那些只在少数细胞出现的突变，很有可能决定了不同肿瘤亚型侵袭性的高低。例如，肿瘤内遗传多样性的程度及肿瘤组织和正常组织的区别，可能影响着免疫系统对正常细胞和恶性细胞的区分能力。因此，找出癌细胞产生突变异质性的机制，就有可能寻找到新的治疗靶点。
三、前景展望
对个体细胞进行分析的新技术不断涌现。目前要确定的是，nuc-seq及其它单细胞基因组技术，例如MALBAC等所得到的检测结果的可信度有多高。例如，很多癌细胞是非整倍体细胞（它们的染色体数目异常），但是，nuc-seq技术可能只局限用于检测不含非整倍体细胞的癌症。此外，虽然基因组测序的成本一直在不断下降，但是，单个细胞基因组测序以及由此对复杂生物信息进行分析的成本依然是惊人的。
在破译癌症基因组的道路上，单个细胞测序技术的出现无疑是一个里程碑。借助这一技术，我们可以对不同患者的肿瘤细胞基因组进行比较，或者比较同一患者在解剖学上相互独立的器官、组织的肿瘤细胞，甚至可以比较同一肿瘤组织内的个体细胞间的差异。这些都让我们更加明确地认识到，肿瘤基因组的动态变化及高度多样性的存在。
单细胞测序将帮助我们对隐藏于癌细胞内的罕见突变进行检测，这些突变可能会最终导致药物抗性的发生，从而从根本上避免给患者服用无效、甚至有毒性的药物进行治疗。最后一点需要引起注意的是，肿瘤细胞基因组的这种高度多态性，是癌症的一大特征，而且很有可能是我们尚未开始开发利用的潜在治疗靶点。癌症的遗传特点在不同患者身上各不相同，例如，同一患者的原发肿瘤和转移肿瘤存在差异，又或者同一肿瘤组织内的个体细胞间也存在差异。
原文检索：Edward J.Foxand & Lawrence A.Loeb. (2014) One cell at a time. Nature, 512:143-144.
筱玥编译
