脱盐换液，就用Sephadex G25

Sephadex G25 是以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析介质，其工作原理主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶分子筛作用，根据被分离物质不同分子大小进行分离筛选。层析时，大于凝胶孔径的大分子，被阻于凝胶相外，沿着凝胶颗粒之间的间隙走，下移速度最快，故最先洗脱下来，中分子物质部份进入凝胶内部，洗脱速度为其次，而小分子物质因全部进入凝胶，受到阻力最大，故最后被洗脱下来。Sephadex G25葡聚糖层析介质分离范围为1～5kD(球形蛋白)，主要用于多肽的分离以及大分子蛋白质的脱盐和缓冲液替换。

脱盐介质&脱盐柱

备注：按凝胶介质粒径不同，Sephadex G25系列介质可分为四类，分别为：Sephadex G25粗， Sephadex G25中等，Sephadex G25细和 Sephadex G25超细，上表的Sephadex G25属于Sephadex G25（M）中等。

产品特性

层析色谱图如下：

应用实例

色谱柱：XK16/30脱盐柱，柱床高度25 cm。

平衡缓冲液：20 mM PB+150 mM NaCl pH 7.0，0.45 μm滤膜过滤。

流速：2 mL/min。

柱平衡：将色谱柱连接至纯化仪器，使用平衡缓冲液冲洗脱盐柱 2-3 倍柱体积（Column Volume，以下简称 CV）。

加载样品：某蛋白样品，上样体积为1 mL。为尽可能增加层析柱的使用寿命，样品上样前须进行澄清处理，如 10000 g 离心10min 或0.45um 滤膜过滤。

洗脱：使用平衡缓冲液冲洗脱盐柱 2 CV 以上，使用流速不要超过推荐的最大流速。

使用方法

Sephadex G25 系列介质常用于蛋白溶液的脱盐、缓冲液交换和不同分子量蛋白的分离等。

根据不同的用途其上样量也不尽相同，进行缓冲液置换或脱盐时最高可上样 20%柱体积。

1、 介质溶胀

以干态供应的 Sephadex G25 系列介质，使用前必须在过量的溶液中充分溶胀，如 10 g 介质溶胀时加入 100-150 mL 水，溶胀 3 h 以上。沸水浴可加速溶胀速度（如 90℃ 1 h 即可），但要避免剧烈搅拌，以防凝胶破碎。

2、 层析柱填装胶悬液的准备：

计算所需溶胀介质的量（柱床体积为 1 L 时所需 100%沉降胶约为 1.15 kg）。（例如：装填 16/20 柱，柱床高度 10 cm，所需溶胀介质的量为 π×(1.6/2)2×10×1.15=23.11 g 称取 23.11g介质于干净烧杯中，加入一定量（如 12 mL）的装柱溶液，搅拌使其形成均匀的胶悬液。）

装柱：

1）检查层析柱，确保各部件完整、干净。安装下柱头，拧紧 O 型圈后，将层析柱垂直固

定在铁架台上，用水平仪检查并调整，使层析柱保持水平。

2）层析柱中加入适量的装柱溶液，以除去柱子中的空气。拧上底部的堵头，柱内保留 1-2

cm高度的装柱溶液。

3）用玻璃棒紧靠柱内壁引流，将胶悬液连续倒入层析柱中，以减少气泡的产生。介质自然沉降至体积不再变化，此时介质和溶液出现分层，上层溶液完全澄清。

4）连接上柱头至低压层析系统，开泵以一定流速排出管路中残留的空气，暂停系统，将上柱头安装至层析柱上，柱头下端距离胶面约 1 cm，拧紧 O 型圈，开泵以 300-500 cm/h 流速压柱至柱床体积不再变化，继续压柱 5-10 min，用记号笔标定胶面所在位置。

5）暂停系统，拧上底部的堵头，使层析柱上端和泵断开，向下转动调节杆，至记号处以

下 0-0.5 cm 停止，拧上上端堵头。装柱完成。

3、 清洗及再生

在位清洗：为除去变性蛋白、脂蛋白或脂质，需要对介质进行在位清洗。常用的清洗液为0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂，清洗 2-3 CV。

4、 保存条件

20%乙醇或 0.01 M NaOH，室温保存。

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